抗組蛋白H4K8cr兔單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、背景：巴豆酰化是一種進(jìn)化高度保守的翻譯后修飾。組蛋白 H4第8位氨基酸賴氨酸巴豆?；℉4K8cr）主要富集在人類體細(xì)胞和小鼠雄性生殖細(xì)胞中的基因活性轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)和增強(qiáng)子處。由于受到催化Kcr酶研究的限制，目前關(guān)于更多的組蛋白Kcr機(jī)制及功能研究仍然很少。開發(fā)針對組蛋白的翻譯后修飾(PTM)抗體是進(jìn)一步揭示新型表觀遺傳標(biāo)記在腫瘤發(fā)生、發(fā)展與藥物治療中的作用機(jī)理的重要方法。兔單克隆抗體具有親和力高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點，更適合PTM類抗體的開發(fā)

2、。目前急需開發(fā)H4K8cr的兔單克隆抗體，以便加快其生物學(xué)功能的探索和研究。
　　目的：利用兔單克隆雜交瘤技術(shù)和重組抗體技術(shù)開發(fā)能應(yīng)用于免疫印跡、免疫組化和免疫細(xì)胞化學(xué)的H4K8cr兔單克隆抗體。
　　方法：用人工合成的2段多肽H4K8cr多肽，與鑰孔血藍(lán)蛋白（H4K8cr-KLH）交聯(lián)混合免疫4只新西蘭大白兔，獲得最佳免疫效果的兔脾細(xì)胞與240E-W2兔骨髓瘤樣細(xì)胞株融合，運(yùn)用間接 ELISA法篩選能分泌anti-H4K8

3、cr抗體雜交瘤細(xì)胞株。ELISA陽性的雜交瘤細(xì)胞株上清進(jìn)一步通過Western blot、Peptide array等方法進(jìn)行特異性驗證。Peptide array特異性最好、Western blot信號最強(qiáng)的一株細(xì)胞通過重組表達(dá)，超濾濃縮最終得到的抗體通過ELISA、Western Blot、IHC、ICC、Peptide array等方法進(jìn)行特異性鑒定。
　　結(jié)果：初步篩選獲得114株ELISA陽性克隆，20株Western

4、blot陽性克隆，選一株1株P(guān)eptide array特異性最好的克隆73號進(jìn)行重組表達(dá)，共獲得2 mL IgG濃度為1.562 mg/mL的抗體。其效價為1：409600（1×100×212）。Western blot檢測人HeLa、小鼠3T3、大鼠C6和PC-12四種細(xì)胞均能檢測到11 KD的條帶。IHC和ICC結(jié)果顯示anti-H4K8cr染色細(xì)胞定位在細(xì)胞核。ELISA方法驗證與K8非修飾多肽無交叉反應(yīng)。Peptide arra