人肝素酶重組蛋白的表達及其單克隆抗體的制備.pdf

1、研究背景和目的
　　 惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康的最重要的疾病之一。而腫瘤的侵襲和轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤的轉移過程非常復雜,目前認為轉移性癌細胞侵襲轉移主要通過以下三個步驟:1.腫瘤細胞通過細胞表面受體和細胞基質成分的粘附蛋白首先發(fā)生特異性結合,2.細胞外基質的水解酶降解過程,3.降解區(qū)發(fā)生瘤細胞的移動與侵襲。其中參與細胞外基質(ECM)降解過程中起作用的因素備受重視。
　　 肝素酶是1999年由四個

2、不同的實驗室克隆成功的一種腫瘤轉移相關基因,肝素酶(heparanase,Hpa)是唯一能裂解ECM內蛋白多糖主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)的內源性糖苷內切酶。研究表明肝素酶可以通過降解HSPG途徑破壞ECM、BM的完整性以及促進腫瘤新生血管的生成而促進腫瘤的轉移。越來越多的研究證實,肝素酶在幾乎所有的中晚期惡性腫瘤中都高表達,與腫瘤患者的不良預后密切相關,抑制肝素酶

3、的表達可以明顯減少腫瘤的侵襲和轉移。因此,肝素酶有可能作為腫瘤診斷與治療的新靶點。
　　 單克隆抗體(Monoclonal Antibody,McAb)是單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體?？贵w主要由B淋巴細胞合成,每個B淋巴細胞有合成一種抗體的遺傳基因。當機體受抗原刺激時,抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成該細胞的子孫,即克隆。如果選出一個合成一種抗體的細胞進行培養(yǎng),就可得到由單細胞

4、經(jīng)分裂增殖而形成細胞群,即單克隆。單克隆細胞所合成的抗體即為單克隆抗體。1975年Kohler和Milstein首先報道,用細胞雜交技術,使經(jīng)綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠脾細胞,與小鼠骨髓瘤細胞融合,創(chuàng)建了第一個B細胞雜交瘤細胞株,獲得了抗SRBC的單克隆抗體。這是免疫學,乃至醫(yī)學史上的一個里程碑。單克隆抗體的特點是:理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結合的特異性強、便于人為處理和質量控制,并且來源容易。這些優(yōu)點使它一問世就受到

5、高度重視,并成為解決生物學和醫(yī)學等許多重大問題的重要手段。單克隆抗體具有高度特異性、高純度特點,使其在很大濃度范圍內獲得低背景,所以在組織免疫染色中特別有用,還可以應用于免疫沉淀,免疫印跡技術,并且都具有特異性高,背景低的優(yōu)點。另外單抗還可以用來進行免疫親和純化抗原;對單克隆抗體進行標記還可以用做快速診斷以及疫苗的研究等。目前有關肝素酶的單克隆抗體多見于國外公司生產(chǎn),我國尚無商品化的肝素酶單克隆抗體。單純的從國外進口該抗體,價格昂貴,成

6、本高。
　　 基于以上認識,本研究擬構建人肝素酶高效表達基因,以獲得人肝素酶重組蛋白,再利用獲得的高純度肝素酶蛋白作為免疫原,采用常規(guī)免疫程序和雜交瘤技術篩選人肝素酶特異性單克隆抗體,并利用免疫組化、ELISA及Western Blot等技術對獲得的人肝素酶單克隆抗體進行鑒定,最后獲得人肝素酶特異性的單克隆抗體,為以后肝素酶單克隆抗體在臨床診斷以及抗體介導的腫瘤靶向治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法
　　 1.將人肝

7、素酶全長cDNA克隆到pET30a質粒,進一步轉化入宿主菌BL21(DE3)中進行原核表達,采用Ni2+柱純化對人肝素酶重組蛋白進行純化,對表達的人肝素酶重組蛋白進行質譜分析;
　　 2.將獲得的肝素酶蛋白作為免疫源免疫Balb/c小鼠獲得經(jīng)免疫后能產(chǎn)生肝素酶抗體的B淋巴細胞:采用雜交瘤技術制備分泌肝素酶抗體的雜交瘤細胞株;采用有限稀釋法篩選分泌抗體呈強陽性的克隆,并對上清液進行ELISA檢測,鑒定篩選出的陽性克隆;
　　

8、 3.采用HIS親和層析以及復性純化技術純化肝素酶單克隆抗體;獲得的抗體采用Western Blot技術、免疫組化技術及ELISA技術檢測制備的肝素酶單克隆抗體的特異性和抗體的效價。
　　 結果
　　 1.我們采用PCR技術克隆了人肝素酶蛋白編碼基因。經(jīng)測序與GENBANK提供的基因序列完全一致。將克隆的人肝素酶基因序列克隆入原核表達質粒pET30a構建人肝素酶原核表達重組質粒;經(jīng)1.0mmol/L IPTG37℃誘導

9、表達5h,pET30a-Hpa在BL21中表達融合蛋白,分子量為63KD左右,表達量占菌體總蛋白的30％以上。經(jīng)鑒定表達蛋白破菌后主要在沉淀中,為包涵體表達。采用HIS親和層析及復性純化方法,純化獲得人肝素酶重組蛋白;
　　 2.利用純化的人肝素酶蛋白免疫原采用常規(guī)免疫程序和雜交瘤技術,經(jīng)細胞融合,篩選出15株抗人肝素酶的特異性單克隆抗體,經(jīng)亞類鑒定其中有3株為適合應用于診斷試劑的IgG1;
　　 3.經(jīng)免疫組化、ELI

10、SA、及Western等多種手段對獲得的肝素酶單克隆抗體進行特異性分析和效價鑒定,結果顯示所制備的3株單抗為人肝素酶特異的,且效價較高的單克隆抗體。
　　 結論
　　 1.我們采用PCR技術克隆了人肝素酶蛋白編碼基因。獲得了高純度的人肝素酶蛋白,獲得的肝素酶蛋白經(jīng)鑒定其測定分子量與理論分子量相符,可以用于肝素酶單克隆抗體的制備;
　　 2.成功制備了3株人肝素酶特異性的單克隆抗體,獲得的三株人肝素酶單克隆抗體經(jīng)E