油菜細(xì)胞核雄性不育系9012A不育基因BnRfb的克隆與功能分析.pdf

1、油菜是全世界主要農(nóng)作物之一，是食用植物油和飼用蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，其工業(yè)用途也十分廣泛。雜種優(yōu)勢(shì)利用對(duì)油菜產(chǎn)量的提高起到了重要推動(dòng)作用，在雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑中雄性不育的利用是主要途徑之一，細(xì)胞核雄性不育系9012A及其衍生系已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于油菜雜交種商業(yè)化制種，其雄性不育性狀由BnMs3和BnRf兩個(gè)位點(diǎn)控制。為解析9012A雄性不育及其育性恢復(fù)的分子機(jī)理，恢復(fù)基因BnMs3已經(jīng)被成功克隆，其編碼的蛋白與葉綠體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tic40同源;前

2、人對(duì)BnRf位點(diǎn)已經(jīng)精細(xì)定位，并通過(guò)BAC測(cè)序得到了臨保系中等位基因BnRfc的候選區(qū)間。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不育系和恢復(fù)系中BnRf候選區(qū)間序列與臨保系參考序列差異很大。為獲得不育系和恢復(fù)系中BnRf候選區(qū)間真實(shí)序列，構(gòu)建了包含BnRf位點(diǎn)不育基因BnRfb和恢復(fù)基因BnRfa的BAC克隆文庫(kù)，通過(guò)測(cè)序分別得到了包含BnRfb和BnRfa的候選區(qū)間序列，揭示了不育系和恢復(fù)系材料在BnRf位點(diǎn)復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)變異。同時(shí)，

3、通過(guò)分析RG206AB和RG250AB兩個(gè)不同遺傳背景的定位群體，本研究對(duì)BnRf位點(diǎn)育性控制基因進(jìn)行了進(jìn)一步精細(xì)定位，并完成了不育基因的克隆與功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:
　　1、本研究構(gòu)建了一個(gè)甘藍(lán)型油菜基因組BAC文庫(kù)，篩選得到了分別包含BnRfa和BnRfb的BAC單克隆。序列分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于臨保系，不育系和恢復(fù)系在BnRf位點(diǎn)存在一個(gè)大片段插入以及一個(gè)局部序列的倒位，BnRf基因在恢復(fù)系的定位區(qū)間實(shí)際為58.1 Kb，在

4、不育系中相對(duì)應(yīng)的區(qū)間為63.1 Kb。
　　2、根據(jù)不育系和恢復(fù)系中BnRf候選區(qū)間的序列差異，新開(kāi)發(fā)了8個(gè)分子標(biāo)記，通過(guò)分析RG206AB和RG250AB兩個(gè)定位群體，最終將BnRfa限定到35.9 Kb的物理區(qū)間內(nèi)，預(yù)測(cè)包含7個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。
　　3、候選基因G14在不育系和恢復(fù)系中的等位基因，在啟動(dòng)子區(qū)域存在兩個(gè)插入缺失變異，最有可能是目標(biāo)基因。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將包含不育系來(lái)源G14全長(zhǎng)的基因組片段AGS1

5、4-1轉(zhuǎn)化到遺傳背景為Bnms3的野生型擬南芥中，獲得了27株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株。表型調(diào)查發(fā)現(xiàn)27個(gè)陽(yáng)性單株都表現(xiàn)為花絲短小，花藥皺縮，沒(méi)有可育花粉，其雄性不育表型與RG206A十分相似;T1代陽(yáng)性單株與野生型雜交，在T2代分離群體中，雄性不育表型與AGS14-1轉(zhuǎn)基因片段共分離。進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)觀察表明，不育擬南芥與RG206A花藥的異常發(fā)育過(guò)程也基本相同。不僅如此，外源導(dǎo)入BnMs3還能夠徹底恢復(fù)AGS14-1導(dǎo)致的擬南芥雄性不育，這與甘

6、藍(lán)型油菜中BnMs3能夠特異性恢復(fù)9012A類(lèi)型不育系的育性相一致。因此，可以確認(rèn)基因組片段AGS14-1包含導(dǎo)致RG206A產(chǎn)生雄性不育的BnRfb基因。
　　4、將恢復(fù)系中與AGS14-1等位的基因組片段AGS14-2導(dǎo)入擬南芥野生型，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株也均表現(xiàn)為雄性不育，因此恢復(fù)系來(lái)源的基因組片段AGS14-2可能也包含雄性不育基因BnRfb。因而推測(cè)，BnRf位點(diǎn)恢復(fù)基因BnRf口與不育基因BnRfb可能并不等位，恢復(fù)基因可能

7、對(duì)應(yīng)于35.9 Kb候選區(qū)段內(nèi)的另一個(gè)基因。
　　5、AGS14-1和AGS14-2片段上都包含預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框G14，其蛋白編碼序列完全相同。通過(guò)PCR從RG206H花藥cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增獲得的G14全長(zhǎng)CDS包含9個(gè)外顯子，編碼一個(gè)1386個(gè)氨基酸的蛋白。DNA水平和蛋白水平的同源性分析表明G14是一個(gè)嵌合基因，由3段與不同基因同源的序列組成。由于G14中較大一段序列與mtHSP70-1高度同源，因此我們將G14命名為BnaA

8、7.mtHSP70-1-like。在可育材料RG206H中，BnaA7.mtHSP70-1-like在花藥發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，在減數(shù)分裂時(shí)期其表達(dá)水平較高;而在不育材料RG206A中，BnaA7.mtHSP70-1-like僅在花藥發(fā)育的減數(shù)分裂時(shí)期有微弱表達(dá)。
　　6、油菜核不育基因BnaA7.mtHSP70-1-like在擬南芥中異位表達(dá)，對(duì)絨氈層分化相關(guān)基因沒(méi)有明顯影響，但卻明顯抑制了絨氈層退化相關(guān)基因的表達(dá)。與此相一

9、致，在油菜不育系RG206A中我們觀察到絨氈層細(xì)胞的PCD明顯延遲。
　　7、在公用數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)分析，僅在甘藍(lán)參考基因組上找到一個(gè)BnaA7.mtHSP70-1-like基因的同源基因，擬南芥及其他物種中均沒(méi)有該嵌合基因的同源基因。甘藍(lán)型油菜和白菜參考基因組上也不存在BnaA7.mtHSP70-1-like或其同源基因，但本研究對(duì)190份甘藍(lán)型油菜及24份白菜材料進(jìn)行分析，其中有52份甘藍(lán)型油菜及20份白菜材料包含BnaA7