上海地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒流行株檢測(cè)分析及siRNA的干擾效應(yīng).pdf

1、原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者(需親筆，簽“:鈞tj，堆朔少日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)

2、構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密口，在_年解密后適用本授權(quán)書(shū)。本學(xué)位論文屬于不保密口。(請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“V學(xué)位論文儲(chǔ)(需親筆’簽“:甸鄒導(dǎo)師‘需”’簽“’以xAvor年4月)日、公年華月冷日is海地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒流行株檢測(cè)分析及SiRNA的千擾效應(yīng)采用MBGA軟件分析所有分離

3、株S2片段同源性，可以看出上海地區(qū)流行株S2片段同源性非常高(”%)，表明至少在一定時(shí)期(2002年一2003年)內(nèi)，流行毒株的變異率不高，這為研制和使用相應(yīng)的疫苗提供了可能.從GenBank中下載相應(yīng)IBVS2基因片段，比較發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)分離株與其他地區(qū)賢變型IBV有較高同源性(=91%)與參考呼吸型毒株間差異較大(=88%同源性)，上海地區(qū)流行毒株與一株山東青島膝可型分離毒〔SD9702)同源性較高，但與浙江腺胃型分離毒株ZJ971分

4、子差異較大.國(guó)內(nèi)分離株ZJ971與我國(guó)使用的疫苗株H52均處于北美流行群中，且二者同源性很高，ZJ971S基因可能來(lái)源于疫苗株H52.除一株北京地區(qū)分離株分子特征較為特殊外，我國(guó)分離株均處于一個(gè)分支內(nèi)，表現(xiàn)出一定的區(qū)域特性。以我國(guó)近年來(lái)報(bào)道的不同組織嗜性IBVS基因作為分析參考序列(除SD9702毒株未見(jiàn)相關(guān)S1序列外)，發(fā)現(xiàn)，無(wú)論利用SI全基因還是S1基因片段進(jìn)化分析均顯示:浙江腺胃型分離株ZJ971與呼吸型參考株H52為親源關(guān)系較近

5、的一支而國(guó)內(nèi)呀變型分離株LH20110和LX4組成進(jìn)化中的另一分支。表明S1基因片段同S1一樣，能反映IBV的進(jìn)化規(guī)律和親緣關(guān)系。盡管IBVS2片段間變異率明顯低于SI，二者在毒株間表現(xiàn)出相同的進(jìn)化趨勢(shì)及親緣關(guān)系，S2片段可用于IBV分子變異規(guī)律分析.2SiRNA對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)IBV的RNA干擾作用研究比較已發(fā)表的IBV基因組序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)IBV各基因組片段的SiRNA1280個(gè)，通過(guò)同源性比較和保守性分析，篩選符合條件的SiRNA12個(gè)

6、，分別針對(duì)PolMN基因。在IBV接種到Ver。細(xì)胞前68h、接種后2h，利用化學(xué)方法轉(zhuǎn)染SiRNA培養(yǎng)12h后，在轉(zhuǎn)染N1221Po150siRNA細(xì)胞內(nèi)，觀察到IBV病毒粒子明顯少于對(duì)照接種細(xì)胞，表明IBV增殖受到抑制。提取正常Ver。細(xì)胞、IRV接種細(xì)胞、轉(zhuǎn)染siRNA病毒接種細(xì)胞的總RNA，采用建立的多聯(lián)RTPCR方法，以細(xì)胞持家基因口actin做內(nèi)參，檢測(cè)mRNAN基因豐度，再利用非變性蛋白凝膠電泳，Westernblot檢測(cè)

7、IBV蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后，IBVmRNA及合成的蛋白下降，顯著低于IBV細(xì)胞接種組，表明siRNAPo150N1221抑制了IBV在Vero細(xì)胞上的增殖。分別對(duì)N1221的正、負(fù)鏈進(jìn)行修飾(每個(gè)核普酸2OH被0CH3取代)，形成的雙鏈RNA中被修飾的一條鏈不能與相應(yīng)的靶mRNA作用，從而失去RNA干擾作用.轉(zhuǎn)染修飾后siRNA的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染野生型siRNA的細(xì)胞，經(jīng)IBV熒光杭體染色發(fā)現(xiàn)，負(fù)鏈被修飾的siRN人轉(zhuǎn)染細(xì)胞與野