雞傳染性支氣管炎病毒BD株生物學(xué)特性鑒定及RT-PCR檢測方法的建立.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由冠狀病毒科(Coronaviridae)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。此病多發(fā)于幼年雞，病雞的特征性臨床癥狀為咳嗽、噴嚏、氣管噦音，蛋雞產(chǎn)蛋量及蛋品質(zhì)下降，對(duì)雞的腎臟和生殖系統(tǒng)還可造成一定的損害。IB在世界范圍內(nèi)分布，雖然已廣泛應(yīng)用疫苗，但由于各血清型的分離毒

2、不斷出現(xiàn)，其發(fā)生仍然十分普遍，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，我國IB的發(fā)生己經(jīng)遍布全國大部分省、市和自治區(qū)，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的損害。本研究主要是從河北保定地區(qū)某雞場疑似雞傳染性支氣管炎的發(fā)病雞病料中分離到一株病毒，命名為BD株，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，進(jìn)而建立起一套快速準(zhǔn)確地臨床檢測方法。 無菌采集疑似雞傳染性支氣管炎病料，將病變明顯的腎臟、器官、肺臟制成病毒液，按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)9～11日齡SPF雞胚傳代，雞胚在接種后

3、2～9天內(nèi)出現(xiàn)卷曲、侏儒胚等IBV致雞胚特征性病變。在電鏡下可以見到典型的冠狀病毒粒子，未見到其他病毒粒子。所見病毒粒子呈圓形，有稀疏排列的纖突。未經(jīng)胰酶處理的尿囊液對(duì)SPF雞紅細(xì)胞沒有凝集作用。攻毒后，BD株接種雞僅在1～2d出現(xiàn)輕微的臨床癥狀，表現(xiàn)為病雞呼吸困難、羽毛松亂、精神沉郁。攻毒后第4d，部分接毒雞開始死亡，死亡時(shí)間在5～11天不等。多數(shù)病雞剖檢后，肉眼可見到器官出血、水腫、盲腸扁桃體等器官出血。所有死亡雞均表現(xiàn)腎臟腫大、蒼

4、白，腎臟和輸尿管內(nèi)有白色的尿酸鹽沉積，呈典型的“花斑腎”。隨著病程延長，腎臟腫大更加明顯。將病毒液進(jìn)一步經(jīng)致雞胚矮小化試驗(yàn)、新城疫干擾試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果都符合IBV生物學(xué)特性。以分離病毒的cDNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出M基因405bp長的片段，從核酸水平證實(shí)了所分離的病毒為IBV。以上鑒定結(jié)果表明從該雞場分離到的病毒為雞傳染性支氣管炎病毒。 本試驗(yàn)對(duì)BD株進(jìn)行了理化特性的研究，該病毒經(jīng)氯仿和乙醚作用后EIDso發(fā)生明顯的

5、變化，表明BD株對(duì)二者敏感；耐熱性試驗(yàn)表明BD株對(duì)熱敏感，但二價(jià)鎂離子可提高此病毒對(duì)熱的耐受性；酸堿敏感試驗(yàn)表明BD株對(duì)PH3.0與PHl2.0的酸堿環(huán)境均有一定的抵抗力。經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，兔抗雞胚毒血清瓊擴(kuò)滴度為1:64；通過半數(shù)雞胚感染量的交叉中和試驗(yàn)鑒定分離株的血清型，結(jié)果BD株與M41標(biāo)準(zhǔn)毒株有一定交叉反應(yīng)，中和試驗(yàn)R值為67％，表明BD株病毒與M41標(biāo)準(zhǔn)毒株為同一血清型不同亞型。 根據(jù)GenBank已發(fā)表的30株雞傳

6、染性支氣管炎病毒(IBV)M基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增出405bp特異性核酸片段，建立了檢測IBV的RT-PCR方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，IBV M41標(biāo)準(zhǔn)株和BD株均能擴(kuò)增出405bp的核酸片段，而新城疫病毒(NDV)、鴨肝炎病毒(DHV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、正常雞胚尿囊液無特異性條帶出現(xiàn)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的最低檢出限量為5×10-3EID50的模板。表明本試驗(yàn)所建立的RT-PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)的特