基于結(jié)構(gòu)的對于水稻和稻瘟病菌相互作用所包含蛋白的計(jì)算研究.pdf

1、本研究探討了在水稻和稻瘟病菌全蛋白組中使用基于蛋白結(jié)構(gòu)的計(jì)算方法來篩選可能參與兩者相互作用過程的蛋白的可能性。研究總共使用了來自TIGRRice v5的66710條蛋白序列和來自Broad M grisea v6的11054條蛋白序列。我們使用了多種基于計(jì)算的方法來分析這些蛋白序列。本研究不僅僅提供了水稻和稻瘟病菌中那些可能與稻瘟病致病機(jī)制相關(guān)的基因產(chǎn)物以及與之相關(guān)通路的信息，也提供了一種篩選植物——病原菌相互識別過程中可能起作用的基因

2、產(chǎn)物的不依賴于已有知識的手段。
　　 本研究的目的是設(shè)計(jì)一套方法來篩選出那些可能參與這兩個(gè)物種之間細(xì)胞表面識別的基因產(chǎn)物，并且這種篩選的方法不建立在對該兩物種具有專業(yè)背景知識和對其入侵——抵抗過程有具體了解的基礎(chǔ)之上。較好的方法是使用GeneOntology(GO)來對編碼基因產(chǎn)物進(jìn)行功能分類。對篩選出來的蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，并對其進(jìn)行雙盲蛋白對接測試。有一些通用的信號通路如cAMP和MAPK信號通路被證明參與了附著胞的形成。

3、本研究對于篩選出來的可能參與該兩物種間宿主——寄主識別的基因產(chǎn)物進(jìn)行了文獻(xiàn)方面的查閱，并發(fā)現(xiàn)與該領(lǐng)域內(nèi)其它研究者的報(bào)道一致。這些研究中有些是對相關(guān)基因或片斷的直接測序，有些是借助于基因芯片的方法，還有一些則是使用了酵母雙雜交體系來研究這種相互作用。
　　 只有水稻蛋白組中的18個(gè)蛋白(共66710個(gè))以及稻瘟病菌蛋白組中的24個(gè)蛋白(共11054個(gè))最后通過了本研究所設(shè)計(jì)的嚴(yán)格流程——細(xì)胞內(nèi)定位信息的篩選，蛋白三維建模，雙盲蛋白

4、對接測試，結(jié)果的人工驗(yàn)證。包括30對這些蛋白之間的相互作用。這些蛋白被認(rèn)為參與了一些重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝通路，并且這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝通路與細(xì)胞的表面識別和細(xì)胞外被的降解有關(guān)。具體結(jié)果按照流程分步敘述如下：
　　 對蛋白編碼基因產(chǎn)物的GO條目的分配
　　 水稻蛋白組中，總共有39587個(gè)基因產(chǎn)物至少被分配了一個(gè)GO條目，這些基因產(chǎn)物在雙序列聯(lián)配中的匹配長度超過100個(gè)氨基酸殘基，并且匹配的P值小于0.05。這些編碼基因

5、產(chǎn)物占水稻蛋白組的59.34％。作為對照，在模式植物擬南芥中，這一比例達(dá)到了98.53％(27445)。在稻瘟病菌蛋白組中，有5545個(gè)基因產(chǎn)物被分配了至少一個(gè)GO條目，約占全蛋白組的49.21％。在玉米黑粉菌(也是一種主要的植物病原菌)中，這一比例上升到59.16％，有3874個(gè)蛋白被分配了至少一個(gè)GO條目。在得到更廣泛關(guān)注的模式生物——釀酒酵母中，有5879個(gè)蛋白在GO數(shù)據(jù)庫中存在對應(yīng)的同源蛋白，幾乎包含了該物種中已知的全部蛋白。<

6、br>　　 水稻和稻瘟病菌中蛋白的細(xì)胞組分分析
　　 對篩選出來的39587個(gè)水稻及5545個(gè)稻瘟病菌的蛋白進(jìn)行了GO瘦條目定位的分析。大概有3.82％(1151個(gè)，無冗余)的水稻蛋白的細(xì)胞定位被認(rèn)為與質(zhì)膜和胞外基質(zhì)有關(guān)(GO:0005576，GO:0005578，GO:0005615，GO:0005618，GO:0005886，GO:0030312，GO:0030313)。在稻瘟病菌中，這個(gè)比例接近8.60％(477個(gè))。這

7、里我們使用了細(xì)胞組分而不是常用的分子功能來進(jìn)行分析以篩選出符合要求的蛋白。這些蛋白可能在病原微生物和宿主之間發(fā)生的細(xì)胞表面接觸和識別中起作用，并由此在這兩個(gè)不同物種的細(xì)胞內(nèi)啟動相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。本分析基于目標(biāo)序列與GO數(shù)據(jù)庫中已知功能的蛋白序列之間存在相似性。蛋白建模和雙盲蛋白對接測試
　　 那些被認(rèn)為可能存在于胞外基質(zhì)或細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架上的蛋白中只有相當(dāng)少的部分最終通過了蛋白建模和雙盲蛋白對接測試。為了描述的方便，這些蛋白被

8、分成三組：位于胞外空間的酶，細(xì)胞膜上參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游組分，細(xì)胞骨架及胞外基質(zhì)骨架的結(jié)構(gòu)性組分。
　　 在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了一些已經(jīng)被報(bào)道的酶。如在稻瘟病菌蛋白組中找到了XYL-6的一些亞型(MGG06593，MGG_07955，MGG_08401，MGG-08424，MGG15430)。XYL-6是一種木聚糖酶(EC3.2.1.8)，它可以將木聚糖降解成木糖，從而破壞半纖維素。而半纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分之一。
　　 殼

9、多糖的生物合成和降解是影響真菌的細(xì)胞形狀和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的重要因素。殼多糖酶(EC3.2.1.14)是參與真菌細(xì)胞壁中殼多糖重塑過程的一種重要的酶，而這種重塑對于菌絲的生長有相當(dāng)重要的作用。最后通過本步驟測試的稻瘟病菌蛋白中，存在兩個(gè)殼多糖酶，MGG03599和MGG10333。
　　 本步驟篩選出來的結(jié)果中有一些上游的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分和一些位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Mg-NCS-1是鈣調(diào)蛋白(CaM)家族中的一員，稻瘟病菌蛋白組中

10、存在它的同源蛋白MGG01550，后者通過了嚴(yán)格的蛋白建模和蛋白對接測試。此外，MGG-01550也被認(rèn)為參與了cAMP信號通路。
　　 網(wǎng)格蛋白接頭復(fù)合體(AP-1)的功能中最重要的是它參與了網(wǎng)格蛋白包被小泡的形成。這是最經(jīng)典的將胞外分子從細(xì)胞表面運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)膜空間的胞吞作用途徑。這種內(nèi)化作用有組成性的，也有受細(xì)胞信號調(diào)節(jié)的。稻瘟病菌蛋白組中一個(gè)注釋信息為“AP-1 complex subunit sigma-1”的蛋白，MG

11、G_11227，與Schizosaccharomyces pombe中已知功能的蛋白SPAP27G11.06c具有58％的氨基酸水平上的相似性，該匹配的e-value為3.67e-49。
　　 此外，在稻瘟病菌和水稻的蛋白組中均找到了一組微絲或微管蛋白細(xì)胞骨架組分及其相關(guān)蛋白(MGG_03164，MGG_06650，MGG_06884，MGG_11167，LOC_Os02914000，LOC_Os03963690，LOC_Os1

12、0g43040)。在絲狀真菌中，肌動蛋白細(xì)胞骨架對于菌絲中極性的建立和維持以及分裂時(shí)收縮環(huán)的形成都是必須的。
　　 通路查找
　　 只有水稻中的兩個(gè)蛋白達(dá)到了ptools中內(nèi)建的搜索閾值。在RiceCyc2.0.1中，LOC_Os07910600編碼的蛋白具有假定的cycloartenol-C-24-methyltransferase活力。該酶被認(rèn)為催化了固醇生物合成、環(huán)丙烷和環(huán)丙稀脂肪酸生物合成、環(huán)丙烷脂肪酸(CFA)

13、生物合成等三個(gè)代謝通路中的四個(gè)反應(yīng)。另一個(gè)水稻位點(diǎn)LOC_Osllg37890編碼一個(gè)假定的GDP-甘露糖.3'，5'-異構(gòu)酶(EC1.1.1.145)。該酶被認(rèn)為參與了brassinosteroid biosynthesis II代謝通路。
　　 此外，在稻瘟病菌蛋白組中找到了兩個(gè)Gallus gallus中鈣調(diào)蛋白P62149的同源物(MGG_06884，MGG11167)。
　　 為了了解在植物——病原菌最初識別過

14、程中起關(guān)鍵作用的內(nèi)在機(jī)制，我們使用了基于結(jié)構(gòu)的方法來篩選可能在水稻和稻瘟病菌細(xì)胞表面識別過程中起作用的蛋白，然后對這些篩選出來的蛋白進(jìn)行文獻(xiàn)搜索以確定它們所在的代謝和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這種基于結(jié)構(gòu)的方法有一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)就是：目標(biāo)蛋白的具體信息并不是必需的。
　　 在蛋白建模過程中，PROSPECT II的模板庫更新是一個(gè)主要的問題，這個(gè)問題也存在于其它許多非商業(yè)的結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件中。無論把系統(tǒng)生物學(xué)作為一個(gè)研究領(lǐng)域還是僅僅作為一個(gè)樣