稻瘟病菌Rab蛋白的定位與生化功能分析.pdf

1、稻瘟病是世界性的水稻重要病害之一，該病發(fā)生直接關(guān)系到世界各國糧食安全。其病原稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）已成為研究絲狀真菌生長發(fā)育和侵染致病機(jī)制的重要模式生物，其侵染過程錯(cuò)綜復(fù)雜，包括分生孢子的萌發(fā)、附著胞的形成和分化、穿透寄主組織后定殖和擴(kuò)展等過程，涉及到諸多膜運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等復(fù)雜的生理活動。研究表明，胞吞作用與稻瘟病致病性相關(guān)。
　　Rab蛋白作為分子開關(guān)，在胞吞、胞吐和貨物循環(huán)途徑等過程中發(fā)揮了

2、重要的作用。每一個(gè) Rab都能靶定到一個(gè)特異的細(xì)胞器上，通過其上游調(diào)控因子和下游特定的效應(yīng)子的輔助，實(shí)現(xiàn)活性態(tài)GTP結(jié)合形式和失活態(tài)GDP結(jié)合形式的循環(huán)，進(jìn)而調(diào)控著囊泡運(yùn)輸?shù)母鱾€(gè)過程。稻瘟病菌中含有11個(gè)假定的Rab蛋白，本研究在哺乳動物細(xì)胞中克隆并表達(dá)了其中6個(gè)假定 Rab蛋白 MoRab1、MoRab8、MoRab11、MoYpt7、MoRab5A和MoRab5B，并檢測了這些Rab蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。鑒于MoRab5B是稻瘟病菌侵

3、染致病所必需的，而 MoRab5A敲除突變體是致死的，本研究深入地分析了MoRab5A和MoRab5B的生化特性和功能特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MoRab5A和MoRab5B都能與人類Rab5（hRab5）共定位于細(xì)胞內(nèi)的早期內(nèi)涵體上。同樣地，MoRab1、MoRab8、MoRab11分別與其相應(yīng)的 hRabs定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)吞囊泡和循環(huán)囊泡，表明它們確實(shí)是哺乳動物中相應(yīng) Rabs的直系同源物。相反，MoYpt7彌散地分布在細(xì)胞內(nèi)，可能因其轉(zhuǎn)錄后的

4、異戊二烯化和靶定到晚期內(nèi)涵體膜上的過程受阻。
　　此外，與hRab5類似，MoRab5A和MoRab5B在GTP活性態(tài)時(shí)與Rab5的一些效應(yīng)因子結(jié)合，包括EEA1、Rabenosyn-5和Rabaptin-5。然而GST pull-down實(shí)驗(yàn)顯示，MoRab5A:WT（野生型）和MoRab5A:CA（持續(xù)激活突變體）都能與效應(yīng)因子相互作用，且作用強(qiáng)度相同，表明 MoRab5A在 GTP水解中可能存在缺陷，在細(xì)胞中大部分以GTP形

5、式存在。GTP水解實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MoRab5A的GTP酶活性比MoRab5B和hRab5低很多，而且對RabGAP5的促進(jìn)作用也不敏感。進(jìn)一步分析了MoRab5A和MoRab5B的嵌合體和突變體，結(jié)果表明，MoRab5A在Switch I區(qū)域含有Pro殘基，是其區(qū)別于MoRab5B和hRab5的關(guān)鍵位點(diǎn)。MoRab5A和MoRab5B在細(xì)胞中的功能也是不同的。盡管兩者都能靶定到早期內(nèi)涵體上，但是只有MoRab5B和hRab5一樣，促進(jìn)了早期

6、內(nèi)涵體的融合以及液相內(nèi)吞作用，并在NGF誘導(dǎo)的神經(jīng)突觸的生長過程中發(fā)揮了負(fù)調(diào)控的作用。相反，MoRab5A則與另一個(gè)早期內(nèi)涵體成員Rab22的結(jié)構(gòu)相似，在分子開關(guān)I區(qū)域都含有Pro氨基酸并阻礙了GTP酶的活性。我們的結(jié)果鑒定出MoRab5B是Rab5的直系同源物，暗示了MoRab5A在內(nèi)涵體的分選過程中特異地發(fā)揮了非冗余的功能。
　　綜上所述，在稻瘟病菌中，從真核生物最后的祖先（LECA）到哺乳動物的進(jìn)化過程中，MoRab5B和M