稻瘟病菌激活蛋白活性測(cè)定與基因的克隆表達(dá).pdf

1、本文針對(duì)新型植物蛋白激發(fā)子生物農(nóng)藥——稻瘟菌激活蛋白進(jìn)行了深入的研究，主要包括稻瘟菌激活蛋白的基因定位、稻瘟菌激活蛋白提純、蛋白的活性測(cè)定和基因克隆及表達(dá)等方面，結(jié)果如下： 1、通過(guò)NCBI網(wǎng)上查詢，將稻瘟菌激活蛋白基因序列與已測(cè)定的稻瘟菌基因組序列進(jìn)行比對(duì)，得出此蛋白基因位于稻瘟菌基因組的第3條染色體上。 2、分別用pH為6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸提取緩沖液和Tris-HCL提取緩沖液從稻瘟菌菌塊中提取稻瘟菌

2、激活蛋白，對(duì)比不同緩沖液提取的結(jié)果來(lái)看，用Tris-HCL提取緩沖液提取的42KD蛋白條帶較為清晰，用磷酸提取緩沖液提取的42KD蛋白條帶濃度比用Tris-HCL提取緩沖液提取的高，但是用磷酸提取緩沖液提取的其它雜蛋白數(shù)量相應(yīng)增多，其濃度也相應(yīng)升高；對(duì)比不同pH值來(lái)看，pH值為7.5的Tris-HCL提取緩沖液提取的蛋白條帶比其它要清晰，pH值為8.0的磷酸提取緩沖液提取的蛋白條帶明顯弱于其它3種。因此在提取日本稻瘟菌激活蛋白時(shí)用pH值

3、為7.5的Tris-HCL提取緩沖液提取的效果比較好。 3、用激活蛋白處理絲瓜、豌豆和番茄種子，觀測(cè)其發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示本稻瘟菌激活蛋白能顯著促進(jìn)絲瓜、豌豆和番茄種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)；從日本稻瘟菌激活蛋白對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響來(lái)看，稀釋100倍的日本稻瘟菌激活蛋白對(duì)水稻的生長(zhǎng)有較大的促進(jìn)作用。用稻瘟菌處理煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液之后進(jìn)行纖維素酶、過(guò)氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定，在處理1h后均與對(duì)照產(chǎn)生較明顯的

4、差異。因此可將其作為蛋白活性的快速檢測(cè)指標(biāo)。 4、根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和目的基因序列設(shè)計(jì)引物，以提取的稻瘟菌基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出目的蛋白基因DW-1和DW-2，繼而分別構(gòu)建非融合表達(dá)載體pBV221-DW-1和融合表達(dá)載體pGEX-KG-DW-2。將構(gòu)建好的兩個(gè)載體分別進(jìn)行溫度誘導(dǎo)與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明連有目的蛋白的pGEX-KG-DW-2載體加誘導(dǎo)物在BL21中表達(dá)，在比66KD稍大處有一條