脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解菌的篩選、降解酶的純化及其降解效果的初步研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素(DON)又稱為嘔吐毒素,廣泛存在于大自然中,能夠?qū)任锖惋暳蠋韲?yán)重污染,是一種全球性的污染毒素。目前,生物降解法被認(rèn)定為是降解DON的最佳方法。基于以上所述,本文篩選出一株產(chǎn)DON降解酶的菌株,對其進(jìn)行了形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定,純化了DON降解酶并對其進(jìn)行分析鑒定和相關(guān)性質(zhì)研究,用純化的降解酶作用于DON對其降解效果和降解產(chǎn)物進(jìn)行分析研究。研究結(jié)果如下:
　　(1)從土壤中分離的53個(gè)單菌落和15個(gè)供試菌種

2、中初篩得到3株菌種B-1、F-1和F-2,經(jīng)過復(fù)篩發(fā)現(xiàn)菌株F-1胞內(nèi)液的酶活力高達(dá)56.5,表明該降解酶為一種胞內(nèi)酶。
　　(2)對菌株F-1進(jìn)行形態(tài)鑒定和ITS鑒定,將擴(kuò)增的目的基因與Genbank數(shù)據(jù)庫(NCBI)進(jìn)行Blast序列對比,鑒定結(jié)果顯示菌株F-1與多株黑曲霉同源性均達(dá)到99％,表明菌株F-1是一株黑曲霉。
　　(3)對菌株F-1中的降解酶進(jìn)行分離純化,SDS-PAGE電泳結(jié)果為單一條帶,說明得到較純的降解酶

3、,其純化倍數(shù)為42.6,回收率達(dá)到26.2%。
　　(4)液相質(zhì)譜(1D-LC-MS)分析鑒定結(jié)果顯示該降解酶的含354個(gè)氨基酸,分子量為40.5kDa,等電點(diǎn)為6.01,測得的氨基酸序列與NIBC的數(shù)據(jù)庫中的蛋白YALI0A01441p高度匹配,表明該降解酶為一種脂肪酶。
　　(5)降解酶的性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),酶的最適反應(yīng)溫度和最適 pH分別為40℃和8.5,Ca2+、Mg2+(1.0mM)和Fe2+能夠進(jìn)一步激活酶的活性,Zn

4、2+和Cu2+則是很強(qiáng)的酶活抑制劑。有機(jī)溶劑對酶活力的影響降序排列順序?yàn)?甲醇>乙醇>DMSO>EDTA>丙酮。
　　(6)高效液相色譜(HPLC)檢測結(jié)果表明,DON被脂肪酶降解,其降解率達(dá)70%以上。薄層色譜(TLC)檢測結(jié)果顯示,在365nm紫外燈的照射下,可見DON的降解產(chǎn)物的白色亮斑,其Rf值為0.28。
　　(7)液相質(zhì)譜(LC-MS)對DON的降解產(chǎn)物分析結(jié)果顯示, DON經(jīng)過脂肪酶的降解,分子量從原來的296