脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠胚胎干細胞的毒性作用.pdf

1、目的:
　　 利用小鼠胚胎干細胞(mESCs)為體外試驗模型,探討脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)對mES細胞增殖、周期的細胞毒性作用;對mES細胞階段特異性胚胎表面抗原(SSEA-1)、Nanog、Oct-4、Sox1及Casp-3基因表達情況的影響;對Notch信號通路的作用。為進一步篩選病原體和其他毒素對干細胞增殖、胚胎發(fā)育相關基因表達的作用機制提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用飼養(yǎng)層培養(yǎng)法培養(yǎng)mES細胞

2、,不同濃度的DON(0,50,100,500,1000,2000ng/ml)分別作用于對數(shù)生長期的mES細胞24小時,噻唑藍(MTT)法檢測DON對mES細胞增殖的影響;利用差速貼壁法純化mES細胞,檢測DON對細胞周期的影響;免疫細胞化學法觀察DON對SSEA-1、Nanog、Oct-4、Sox1、Casp-3基因表達情況;Trizol裂解細胞提取mES細胞總RNA,RT-PCR檢測DON對轉(zhuǎn)錄因子Oct-4,Nanog基因的影響;用

3、RIPA細胞裂解液提取mES細胞總蛋白,檢測DON對Notch信號通路基因表達的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.DON對干細胞增殖的影響:
　　 將含有不同濃度DON的培養(yǎng)液加入對數(shù)生長期的mES細胞,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,觀察DON對mES細胞增殖的作用,結(jié)果顯示:隨DON濃度的增加,吸光度值逐漸降低,DON濃度為50ng/ml、100ng/ml時,與空白對照組相比mES細胞增殖及存活率降低,但無統(tǒng)計學差異。當DO

4、N濃度為500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml時,吸光度值明顯降低,與0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組兩兩比較都有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。DON在2000ng/ml時,顯微鏡下觀察mES細胞可見細胞克隆團比500ng/ml、1000ng/ml組減小更加明顯,細胞密度逐漸降低,但無統(tǒng)計學意義。實驗發(fā)現(xiàn)隨DON濃度的增加,抑制mES細胞增殖的作用逐漸增強。
　　 2.DON對細胞周期的影響:

5、r>　　 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:DON作用mES細胞24h后,隨DON濃度的增加,細胞增殖指數(shù)降低。5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組結(jié)果與空白對照組相比區(qū)別不明顯,500ng/ml及2000ng/ml組與0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml組兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。2000ng/mlDON組作用mES細胞后比其它組S期降低顯著,和500ng/ml組比較差異無統(tǒng)計學

6、意義(P＞0.05)。試驗表明DON影響mES細胞周期的分布,具有明顯的抗增殖作用。
　　 3.DON對基因表達的影響:
　　 免疫細胞化學法檢測結(jié)果顯示:DON濃度為100ng/ml時,Nanog、Sox1、Oct-4的表達量與空白對照組相比變化不明顯,而當DON濃度為500ng/ml時,上述基因表達量明顯減少;DON在10ng/ml、100ng/ml及500ng/ml時,casp-3基因表達與空白對照組相比無明顯變化

7、,DON濃度為2000ng/ml組,可見其亮度增加,表達量增多;SSEA-1的表達在500ng/mlDON組,與空白對照組相比,其平均光密度值增加明顯(P＜0.01),差異有統(tǒng)計學意義,1000ng/ml組與500ng/ml組相比,表達量略有增加,但無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)500ng/mlDON組可抑制Oct-4,NanogmRNA的表達,與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。隨濃度的增

8、加,Oct-4,Nanog的表達量降低,但1000ng/ml和500ng/ml組相比,無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 4.DON對Notch信號通路的影響:
　　 Westernblot檢測顯示:當DON濃度為10ng/ml時,NICD表達明顯減少,提示Notch信號通路受到抑制,當DON濃度超過100ng/ml時,表達微弱,Notch信號通路抑制明顯。Notch1受體Jagl、Notch1下游信號Hes1表達也隨

9、濃度增加減少明顯。實驗結(jié)果說明DON影響Notch信號通路,參與Notch信號通路的轉(zhuǎn)導。
　　 結(jié)論:
　　 1.DON對mES細胞有直接毒性作用,能抑制mES細胞的生長,影響細胞周期的分布,抑制細胞進入S期,使細胞停滯在G0/G1期,具有明顯的抗增殖作用。
　　 2.SSEA-1、Octal、Nanog是mES細胞的特異基因,其轉(zhuǎn)錄水平直接影響mES細胞的分化和發(fā)育。DON作用mES細胞后,SSEA-1表達量