脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、目的:
　　 利用小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)對(duì)mES細(xì)胞增殖、周期的細(xì)胞毒性作用;對(duì)mES細(xì)胞階段特異性胚胎表面抗原(SSEA-1)、Nanog、Oct-4、Sox1及Casp-3基因表達(dá)情況的影響;對(duì)Notch信號(hào)通路的作用。為進(jìn)一步篩選病原體和其他毒素對(duì)干細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 采用飼養(yǎng)層培養(yǎng)法培養(yǎng)mES細(xì)胞

2、,不同濃度的DON(0,50,100,500,1000,2000ng/ml)分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mES細(xì)胞24小時(shí),噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)DON對(duì)mES細(xì)胞增殖的影響;利用差速貼壁法純化mES細(xì)胞,檢測(cè)DON對(duì)細(xì)胞周期的影響;免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察DON對(duì)SSEA-1、Nanog、Oct-4、Sox1、Casp-3基因表達(dá)情況;Trizol裂解細(xì)胞提取mES細(xì)胞總RNA,RT-PCR檢測(cè)DON對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4,Nanog基因的影響;用

3、RIPA細(xì)胞裂解液提取mES細(xì)胞總蛋白,檢測(cè)DON對(duì)Notch信號(hào)通路基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.DON對(duì)干細(xì)胞增殖的影響:
　　 將含有不同濃度DON的培養(yǎng)液加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mES細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,觀察DON對(duì)mES細(xì)胞增殖的作用,結(jié)果顯示:隨DON濃度的增加,吸光度值逐漸降低,DON濃度為50ng/ml、100ng/ml時(shí),與空白對(duì)照組相比mES細(xì)胞增殖及存活率降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)DO

4、N濃度為500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml時(shí),吸光度值明顯降低,與0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組兩兩比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DON在2000ng/ml時(shí),顯微鏡下觀察mES細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞克隆團(tuán)比500ng/ml、1000ng/ml組減小更加明顯,細(xì)胞密度逐漸降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨DON濃度的增加,抑制mES細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)。
　　 2.DON對(duì)細(xì)胞周期的影響:

5、r>　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:DON作用mES細(xì)胞24h后,隨DON濃度的增加,細(xì)胞增殖指數(shù)降低。5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組結(jié)果與空白對(duì)照組相比區(qū)別不明顯,500ng/ml及2000ng/ml組與0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml組兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。2000ng/mlDON組作用mES細(xì)胞后比其它組S期降低顯著,和500ng/ml組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義(P＞0.05)。試驗(yàn)表明DON影響mES細(xì)胞周期的分布,具有明顯的抗增殖作用。
　　 3.DON對(duì)基因表達(dá)的影響:
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示:DON濃度為100ng/ml時(shí),Nanog、Sox1、Oct-4的表達(dá)量與空白對(duì)照組相比變化不明顯,而當(dāng)DON濃度為500ng/ml時(shí),上述基因表達(dá)量明顯減少;DON在10ng/ml、100ng/ml及500ng/ml時(shí),casp-3基因表達(dá)與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯變化

7、,DON濃度為2000ng/ml組,可見(jiàn)其亮度增加,表達(dá)量增多;SSEA-1的表達(dá)在500ng/mlDON組,與空白對(duì)照組相比,其平均光密度值增加明顯(P＜0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,1000ng/ml組與500ng/ml組相比,表達(dá)量略有增加,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)500ng/mlDON組可抑制Oct-4,NanogmRNA的表達(dá),與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。隨濃度的增

8、加,Oct-4,Nanog的表達(dá)量降低,但1000ng/ml和500ng/ml組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 4.DON對(duì)Notch信號(hào)通路的影響:
　　 Westernblot檢測(cè)顯示:當(dāng)DON濃度為10ng/ml時(shí),NICD表達(dá)明顯減少,提示Notch信號(hào)通路受到抑制,當(dāng)DON濃度超過(guò)100ng/ml時(shí),表達(dá)微弱,Notch信號(hào)通路抑制明顯。Notch1受體Jagl、Notch1下游信號(hào)Hes1表達(dá)也隨

9、濃度增加減少明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明DON影響Notch信號(hào)通路,參與Notch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 結(jié)論:
　　 1.DON對(duì)mES細(xì)胞有直接毒性作用,能抑制mES細(xì)胞的生長(zhǎng),影響細(xì)胞周期的分布,抑制細(xì)胞進(jìn)入S期,使細(xì)胞停滯在G0/G1期,具有明顯的抗增殖作用。
　　 2.SSEA-1、Octal、Nanog是mES細(xì)胞的特異基因,其轉(zhuǎn)錄水平直接影響mES細(xì)胞的分化和發(fā)育。DON作用mES細(xì)胞后,SSEA-1表達(dá)量