脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒性和生物轉化的研究.pdf

1、真菌毒素是由真菌或霉菌產生的有毒次級代謝產物，廣泛污染各種飼料原料和成品飼料。動物食入被真菌毒素污染的飼料會造成動物的真菌毒素中毒。 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是禾谷鐮刀菌在生長的過程中產生的一種主要代謝產物，是單端孢霉烯族毒素中的一種，廣泛污染各種谷物和飼料。 本論文主要研究在常規(guī)污染劑量下DON對小鼠的毒性和對其生物轉化方發(fā)法。 試驗Ⅰ脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠的生長性能、血液生化和組織病理學的影響。

2、 昆明小鼠40只，分為4組，每組10只，雌雄各半，分別飼喂1mg kg<'1>DON+基礎日糧(1mgDON組)、3mgkg<'-1> DON+基礎日糧(3mgDON組)、5mg kg<'-1>DON+基礎日糧飼料(5mgDON紐)和基礎日糧(對照組)。飼喂20天后分別測定生長性能、血清生化、血常規(guī)和免疫器官的重量(胸腺，脾臟)等指標，并且觀察肝臟、脾臟、十二指腸、胃、腎臟和胸腺的病理變化。結果表明5mg DON組在增重、飼料轉化率、免

3、疫器官的重量(胸腺，脾臟)、紅細胞計數、平均紅細胞體積和血小板計數等方面與對照組相比差異顯著；而1mg DON組和3mg DON組與對照組相比差異均不顯著。在生化方面，5mg DON組血清中的總蛋白、球蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯等方面與對照組相比較差異顯著。5mg DON組的組織器官的病理變化主要表現為：肝臟的淤血、凋亡細胞增加、細胞間的界限不明顯、部分細胞核消失和部分肝細胞腫脹；脾臟被膜增厚、脾小

4、梁增生、部分脾細胞變性壞死、脾臟淤血；胸腺的局部出血；胃絨毛的萎縮和局部出血；十二指腸腸絨毛萎縮或脫落；心肌萎縮、心肌變性、心肌細胞腫脹和腎臟髓質出血、腎小球內有浸出物和部分上皮細胞變性等。 試驗Ⅱ脫氧雪腐鐮刀烯醇對CHO-K1和HL-7702細胞系的細胞毒性在培養(yǎng)基中加入不同濃度DON(DON終濃度分別為0ng mL<'-1>，100ng m<'-1>，200ng mL<'-1>，400ng mL<'-1>，800ng mL<

5、'-1>)，分別用MTT法測定DON對中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)和人肝細胞(HL-7702)的毒性作用，用放射免疫法測定細胞上清液中的白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度。結果表明在低濃度時DON對細胞上清液中(100～200 ng mL<'-1>)IL-2、IL-6和TNF-α的濃度沒有明顯的抑制作用，但是在高濃度(400～800 ng mL<'-1>)時，卻抑制了它們的表達。通過

6、MTT法測得CHO-K1和HL-7702的半抑制濃度(IC<,50>)分別為123.5ng mL<'-1>和336.2 ng mL<'-1>。同時在高濃度(400～800 ng mL<'-1>)時能明顯抑制CHO-K1和HL-7702的生長。試驗Ⅲ脫氧雪腐鐮刀茵烯醇生物轉化茵的分離和鑒定以脫氧雪腐鐮刀茵烯醇(DON)為唯一碳源，通過富集培養(yǎng)從土壤中分離到一株可以生物轉化DON的真菌，編號為NJA-1。用真菌通用引物ITS1和ITS4擴增

7、了該菌的ITS區(qū)間，包括ITS1和ITS2，擴增片段大小為565bp，通過在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數據庫上比較將該菌鑒定了屬，然后用種間引物Bt2a和Bt2b擴增了該菌的β-tubulin基因序列，擴增片段大小為511pb。通過ITS和β-tubulin基因序列分析和形態(tài)學觀察最終鑒定該菌株為塔賓曲霉。該菌的β-tubulin基因序列在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的登錄號為DQ902579，其與塔賓曲霉

8、AY820009的相似性為99％。 試驗Ⅳ NJA-1菌的體外生物轉化和轉化產物的檢測把NJA-1加入含有不同濃度DON的無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃， 120r min<'-1>，振蕩培養(yǎng)14d后，可以轉化94.4％的DON。最高濃度達到40mg L<'-1>。分別用薄層層析(TLC)，高效液相色譜(HPLC)和高效液相色譜一質譜聯(lián)用(HPLC-MS)對DON的生物轉化產物進行了檢測。結果表明在365nm紫外燈下檢測可見其具有熒光

9、。HPLC檢測其既有紫外吸收(波長：218nm)和熒光吸收(Ex=340，Em=450)。HPLC-MS檢測其轉化產物的相對分子量為314.4，其分子量比DON大18.1，證明NJA-1可以水解DON。 試驗Ⅴ生物轉化茵NJA-1對飼料中DON的轉化效果昆明小鼠40只，分為4組，每組10只，雌雄各半，分別飼喂基礎日糧(對照組)5mg kg <'1>DON+5g kg <'1>NJA-1菌(菌+DON組)、5mg kg<'-1>D

10、ON+基礎日糧(5mgDON組)、5g kg <'1>NJA-1菌+基礎日糧飼料(菌組)和。飼喂20天后分別測定生長性能、血清生化、血常規(guī)和免疫器官的重量(胸腺，脾臟)等指標，并且觀察肝臟、脾臟、十二指腸、胃、腎臟和胸腺的病理變化。試驗結果表明在飼料添加5g kg<'-1>的NJA-1菌能減少DON引起的毒性作用。同時在飼料中添加5g kg<'-1>的NJA-1茵沒有對昆明小鼠造成明顯的副作用，該試驗為NJA-1菌的進一步應用研究奠定了