脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)人工抗原合成及其ELISA檢測(cè)方法的研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是禾谷鐮刀菌的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬單端孢霉烯族化合物，主要污染谷物及其制品，溫帶地區(qū)DON的污染比較嚴(yán)重，尤其是在開花季節(jié)或收割季節(jié)雨量偏多時(shí)。人和動(dòng)物食用污染DON的糧食和飼料后不僅可導(dǎo)致急慢性中毒，而且與很多疾病密切相關(guān)。DON分布范圍分廣泛，由于其對(duì)人和動(dòng)物的危害及帶來的經(jīng)濟(jì)損失，各國(guó)對(duì)DON的研究逐步深入，但是我國(guó)的相關(guān)研究相對(duì)較少，特別是檢測(cè)水平偏低。因此，建立針對(duì)脫氧

2、雪腐鐮刀菌烯醇的快速檢測(cè)方法在防止動(dòng)物飼料真菌毒素中毒、控制食品的衛(wèi)生質(zhì)量、保障消費(fèi)者健康、保證畜牧業(yè)正常發(fā)展等方面具有十分重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。 本論文通過對(duì)DON人工抗原合成的研究，建立了DON的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法。用兩種合成方法對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，分別做為免疫抗原和包被抗原用于ELISA檢測(cè)方法的研究，同時(shí)對(duì)ELISA檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終建立DON的ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)分析

3、。其主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1、通過兩種方法——琥珀酸酐法和N，N'-羰基二咪唑法實(shí)現(xiàn)了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和大分子蛋白質(zhì)(BSA/OVA)的偶聯(lián)，并用紫外分光光度法和SDS-PAGE法對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行了定性檢測(cè)，然后用ELISA試劑盒測(cè)得偶聯(lián)物中DON的含量，其中與BSA偶聯(lián)的偶聯(lián)物中DON濃度為0.797μg/μL，與OVA偶聯(lián)的偶聯(lián)物中DON的濃度為0.518μg/μL。 2、將合成的DON人工抗原與等量佐劑混合后，采

4、用頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫昆明小鼠和Balb/c小鼠，每次免疫后采血，分離血清，并用ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)血清效價(jià)，監(jiān)測(cè)抗體產(chǎn)生情況，最終發(fā)現(xiàn)6次免疫后抗體效價(jià)最高。 3、對(duì)間接ELISA檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括包被液的包被時(shí)間和溫度、一抗孵育時(shí)間、HRP酶標(biāo)羊抗鼠抗體的孵育時(shí)間及底物加樣后溫育時(shí)間，并用L16(45)正交表對(duì)這4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)證明，加好包被液的酶標(biāo)板4℃冰箱過夜包被；一抗37℃溫育時(shí)間是60 min；

5、二抗37℃溫育時(shí)間是60 min；加底物顯色10 min后產(chǎn)生的陰陽性抗血清的OD450差值最大。包被液的包被條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最大，其次是一抗和底物作用時(shí)間。由于二抗的溫育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響不大，而且二抗溫育30 min和溫育120 min產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差很小。但從節(jié)約時(shí)間和不降低實(shí)驗(yàn)靈敏度的角度考慮，二抗的孵育時(shí)間定為60 min。 4、實(shí)驗(yàn)表明：乙腈-水(84:16)對(duì)DON具有更好的提取效果；加標(biāo)回收率為86.4～