家蠶核型多角體病毒分子流行病學調(diào)查及宿主特異性研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是家蠶血液型膿病病原，對家蠶幼蟲產(chǎn)生致死性的感染，該病是養(yǎng)蠶業(yè)常見且危害較大的一種病毒病。廣西地處亞熱帶地區(qū)，具有明顯的氣候優(yōu)勢，過去幾年中廣西蠶桑業(yè)得到迅猛發(fā)展，然而，由于養(yǎng)殖密度大，生產(chǎn)期較長，往往容易造成蠶病特別是病毒性傳染病的流行。廣西幾乎每年都會出現(xiàn)BmNPV的流行，而且這些年來由于養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大以及病原體在養(yǎng)蠶區(qū)不斷積累，Bm

2、NPV流行顯示出逐漸加劇的趨勢，給廣西養(yǎng)蠶業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。為了廣西養(yǎng)蠶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，對廣西各地BmNPV流行情況進行調(diào)查，了解病毒傳播特點，將有助于制定相應措施遏制BmNPV在養(yǎng)蠶區(qū)擴大化流行。
　　 本研究從廣西各養(yǎng)蠶區(qū)分別收集了45個野生BmNPV分離毒株，對這些分離株的唯一兩個極晚期表達基因多角體蛋白polh基因和微管相關(guān)蛋白p10基因進行克隆測序，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。序列分析結(jié)果顯示，polh基因高度保守，而p10

3、基因變異較大，頻繁出現(xiàn)核苷酸點突變，表現(xiàn)出密碼子使用多樣化，并沒有明顯的密碼子偏好。根據(jù)p10基因系統(tǒng)進化樹分析，廣西BmNPV分離株主要分為三個群cladesⅠ、Ⅱ和Ⅲ。廣西BmNPV分離株的地理分布顯示，cladeⅠ和Ⅱ分群中的分離株來源地域較為集中而且毗鄰，提示在這些區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)局部的流行與傳播。cladeⅢ的分離株呈不規(guī)律分布于廣西各地，提示有可能發(fā)生遠距離的病毒傳播。廣西桑蠶資源豐富，蠶蟲或者蠶蛹可以作為一種理想的生物反應器，利

4、用桿狀病毒表達系統(tǒng)在其中大量生產(chǎn)重組蛋白，不僅省時省力而且經(jīng)濟節(jié)約?？袢〔《咎堑鞍?Rabies virus glycoprotein，RVG)是主要保護性抗原，能誘導機體產(chǎn)生中和性抗體。本研究使用了一個經(jīng)過基因工程改良的桿狀病毒表達系統(tǒng)，即與BmNPV基因組同源的bacmid缺失了幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸酶基因，構(gòu)建了攜帶RVG基因的重組bacmid，同時引入在哺乳動物細胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的巨細胞瘤病毒啟動子/增強子CMV-IE序列。將重組

5、bacmid與脂質(zhì)體混合注射家蠶幼蟲血腔，進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒。鑒定結(jié)果顯示，重組RVG在蠶蟲機體組織中獲得大量表達，重組表達的RVG最終定位于細胞質(zhì)膜，重組RVG分子量略小于在哺乳動物細胞中表達的天然RVG。但是，多個抗RVG單克隆抗體皆與之發(fā)生反應，且反應的程度與天然RVG的基本一致，提示重組RVG的結(jié)構(gòu)和功能是完好的。針對BmNPV宿主特異性研究表明，無論是體內(nèi)還是體外BmNPV的宿主域相當狹窄。草地夜蛾(Spodopte

6、ra frugiperda，Sf)細胞系Sf9一直被認為是BmNPV的非受納細胞系，BmNPV不能在其中進行有效的復制增殖。本研究中，兩個攜帶有外源報告基因的重組BmNPV，即攜帶狂犬病病毒RVG基因及巨細胞瘤病毒啟動子CMV-IE序列的rBm-PCMV-RVG和攜帶綠色熒光蛋白GFP基因的rBm-GFP，被構(gòu)建并表現(xiàn)出對Sf9細胞具有感染性。該重組BmNPV可以在Sf9細胞中復制增殖，被感染的Sf9細胞無明顯細胞病變，顯示一種無癥狀溫

7、和型的感染狀態(tài)，并且在被感染的Sf9細胞上可以檢測到由低pH值引發(fā)的膜融合反應。以重組rBm-GFP接種Sf9細胞，GFP熒光灶形成和子代病毒滴度增加證實了病毒可以從Sf9細胞中出芽。然而，只有在接種病毒量較大時，重組BmNPV才能在Sf9細胞中復制增殖，且增殖過程與其在受納家蠶細胞系BmN中增殖過程不同;而當接種病毒量較小時，重組BmNPV在Sf9細胞中產(chǎn)生頓挫感染。另外，重組rBm-GFP在Sf9細胞中經(jīng)過系列傳代后顯示出比傳代前的

8、原始病毒復制能力更強。
　　 本文根據(jù)GenBank發(fā)表的家蠶抗BmNPV病毒脂肪酶基因Bmlipase-1和絲氨酸蛋白酶基因BmSP-2序列，分別設(shè)計相應引物，以廣西優(yōu)良家蠶品系“兩廣二號”為實驗材料，成功克隆了該品系家蠶兩個抗病毒基因的完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)，測序并與不同蠶來源的同源基因序列進行比較。實驗結(jié)果顯示:“兩廣二號”家蠶Bmlipase-1基因ORF長度是885bp，編碼29

9、4個氨基酸，BmSP-2基因ORF長度是855bp，編碼284個氨基酸;同源性比較表明二者與其他品系家蠶甚至野蠶和蓖麻蠶的同源序列高度保守，核苷酸和推導氨基酸序列的同源性皆在92％以上，其中Bmlipase-1更為保守，同源性達到99％以上;序列分析發(fā)現(xiàn)各種蠶來源的Bmlipase-1基因脂肪酶活化部位(GXSXG，X為任一氨基酸)的氨基酸序列完全一致，BmSP-2基因酶催化三聯(lián)體(His95，Asp142，Ser236)位點及附近氨基