嗜水氣單胞菌噬菌體的生物學(xué)特性及基因組學(xué)研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種重要的人畜共患病病原，其致病菌株能引起動(dòng)物暴發(fā)性出血病和人類腸胃炎等疾病，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及動(dòng)物和人類的健康構(gòu)成威脅。但現(xiàn)今隨著抗生素的大量使用，許多菌株出現(xiàn)了多重耐藥性，這給該病的防控帶來(lái)一定的挑戰(zhàn)。噬菌體作為一種細(xì)菌病毒，具有高效裂解細(xì)菌的特性。因此研究嗜水氣單胞菌噬菌體對(duì)控制此類細(xì)菌感染具有重要的意義。
　　本試驗(yàn)從地下水和污染河流水樣中分離出兩株嗜水氣單胞菌噬菌體，

2、分別命名為CC2和9-1，并從形態(tài)學(xué)、生理和分子水平對(duì)其特性進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株噬菌體均具有六邊形長(zhǎng)頭部爭(zhēng)收縮性尾部，屬于肌尾病毒科。CC2能裂解25株嗜水氣單胞菌中的6株，在控制嗜水氣單胞菌的感染上具有一定的應(yīng)用價(jià)值。9-1的宿主范圍遍布至少4種氣單胞菌。一步生長(zhǎng)曲線表明CC2潛伏期為20min，生長(zhǎng)期140min，平均感染度為303PFU/cell;噬菌體9-1的潛伏期為25min，生長(zhǎng)期105min，平均感染度為177PFU/c

3、ell。兩株噬菌體對(duì)高溫和低pH均較為敏感。
　　為了全面了解噬菌體CC2的遺傳背景，利用甘油梯度離心純化噬菌體CC2并提取其基因組DNA，采用454高通量測(cè)序法完成基因組測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明噬菌體CC2基因組長(zhǎng)231，743bp，堿基組成為:A=30.05％[69645];G=17.82％[41297];C=21.00％[48668];T=31.13％[72133];A+T=61.18％,G+C=38.82％。采用Glimmer3

4、.0和Prodigal軟件預(yù)測(cè)出噬菌體CC2的基因組可能存在427個(gè)開(kāi)放閱讀框(Openreadingframe，ORF)。通過(guò)BLASTP和RPSBLAST工具在各大核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的檢索，發(fā)現(xiàn)108個(gè)ORFs的基因產(chǎn)物具有預(yù)測(cè)的功能。這些ORFs分布于CC2基因組的3個(gè)相應(yīng)模塊中:DNA代謝與復(fù)制模塊、DNA組裝與結(jié)構(gòu)形成模塊和細(xì)胞裂解模塊。全基因組序列比對(duì)表明，噬菌體CC2和殺鮭氣單胞菌噬菌體65具有較高的同源性，為64％，而與

5、嗜水氣單胞菌噬菌體Aeh1的同源性只有12％。使用MEGA4.1構(gòu)建三個(gè)保守蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果表明噬菌體CC2的末端酶、尾管蛋白和DNA聚合酶與氣單胞菌噬菌體蛋白親緣關(guān)系最近。
　　為了研究噬菌體CC2溶菌酶LysC的溶菌效果，在基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的方法獲得純化的且具有溶菌活性的嗜水氣單胞菌噬菌體溶菌酶LysC。具體方法為:設(shè)計(jì)針對(duì)lysC基因的引物，利用噬菌體CC2原液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得編碼L