紅菜苔春化作用相關(guān)基因及其天然早花突變的分子機(jī)理研究.pdf

1、紅菜苔在我國(guó)南方具有廣泛的種植面積、已有近千年的栽培歷史。與其它屬于冬性一年生蔬菜作物的蕓苔屬植物(如，白菜、甘藍(lán)等)不同，紅菜苔不需要春化就可以較早的開花。紅菜苔與白菜具有很多相似的生理、遺傳特性，是白菜的一個(gè)變種。但與白菜相比，紅菜苔對(duì)春化需求卻表現(xiàn)出巨大的差異。本課題的研究是以天然早花突變體生理、分子生物學(xué)特性為基礎(chǔ)，重點(diǎn)對(duì)控制植物開花的關(guān)鍵基因FLC進(jìn)行研究。FLC是一個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子，受春化作用的抑制，通過抑制下游開

2、花相關(guān)基因的表達(dá)抑制植物開花。FLC低水平表達(dá)與功能的缺失是導(dǎo)致擬南芥、白菜等春化需要植物早花的主要原因。我們以紅菜苔為研究材料，對(duì)紅菜苔早花突變的分子機(jī)理進(jìn)行了深入的研究，并對(duì)一些春化作用相關(guān)基因做了相關(guān)研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)在紅菜苔中克隆出BrpFLC1的兩種不同的剪切產(chǎn)物，分別命名為BrpFLC1-1和BrpFLC1-2是。在BrpFLC1-1中，第六個(gè)內(nèi)含子沒有被完全剪切掉，導(dǎo)致BrpFLC1-1編碼的氨

3、基酸提前終止。在BrpFLC1-2中，由于第六個(gè)外顯子被剪切掉，導(dǎo)致BrpFLC1-2編碼的氨基酸缺失14個(gè)氨基酸。推測(cè)這兩種剪切產(chǎn)物編碼的氨基酸都是沒有功能的。
　　 (2)從紅菜苔中克隆了另外的兩個(gè)FLC的同源基因，分別命名為BrpFLC2和BrpFLC3，分別包含一個(gè)591 bp和618 bp的開放閱讀框。BrpFLC2、BrpFLC3的編碼區(qū)分別編碼196、197個(gè)氨基酸殘基，分子量分別21.91和21.67kD，等電點(diǎn)

4、分別為8.84和9.08。BrpFLC2、BrpFLC3與擬南芥中的AtFLC(NP196576)分別具有84％，82％的同源性。從紅菜苔中克隆的FLC基因與大白菜中的FLC具有很高的同源性。紅菜苔FLC與大白菜的FLC基因相比，只有幾個(gè)核苷酸的差異。
　　 (3) BrpFLC2和BrpFLC3基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸殘基序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，BrpFLC2、BrpFLC3編碼的蛋白具有MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)

5、構(gòu)特性，均有多個(gè)最有可能被磷酸化的位點(diǎn)，沒有發(fā)現(xiàn)可能的O-糖基化位。BrpFLC2、BrpFLC3基因編碼的蛋白與擬南芥和大白菜FLC類似都具有跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示BrpFLC具有典型的MADS-box蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，BrpFLC2、BrpFLC3主要定位于細(xì)胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子參與基因的表達(dá)調(diào)控。
　　 (4)BrpFLC基因的表達(dá)模式研究，BrpFLC1、BrpFLC2在紅菜苔根、莖、葉、子葉中都有較高水平的表達(dá)。Brp

6、FLC3在莖、葉、子葉具有較高水平的表達(dá)，在根中的表達(dá)較低。BrpFLC1、BrpFLC2、BrpFLC3的表達(dá)都受春化作用的抑制，15天的春化處理可以使BrpFLC表達(dá)都降到了很低的水平。春化處理之后，紅菜苔中春化作用相關(guān)基因BrpSOC1和BrpVIN3的表達(dá)量升高，BrpFR1沒有明顯的變化。
　　 (5)對(duì)紅菜苔開花時(shí)間的研究表明，紅菜苔是天然早花突變體，比白菜具有較早的開花時(shí)間。紅菜苔的成花轉(zhuǎn)變不需要春化處理，但是紅菜

7、苔具有一定的春化響應(yīng)，春化處理可以縮短其開花時(shí)間。
　　 (6)BrpFLC1剪切方式的改變是紅菜苔早花的主要原因。與晚花型白菜相比，BrpFLC1剪切的兩種沒有功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。推測(cè)這BrpFLC1剪切出無功能的BrpFLC1是紅菜苔早花的主要原因。推測(cè)FLC1第六個(gè)內(nèi)含子的第一個(gè)堿基G到A改變，可能導(dǎo)致FLC1的剪切紊亂，從而導(dǎo)致紅菜苔早花。
　　 (7)對(duì)BrpFLC的啟動(dòng)子和內(nèi)含子I的研究表明，BrpFLC2啟動(dòng)子

8、與白菜BrFC2啟動(dòng)子具有類似的長(zhǎng)度，序列同源性很高。對(duì)BrpFLC2啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)軟件分析表明，BrpFLC2啟動(dòng)子包含了多個(gè)TATA-box，CAAT-box,以及其他順式作用元件。BrpFLC1和BrpFLC2的內(nèi)含子Ⅰ分別與白菜BrFLC1和BrFLC2的內(nèi)含子I具有類似的長(zhǎng)度，序列同源性很高。沒有發(fā)現(xiàn)BrpFLC基因的這些區(qū)域與紅菜苔天然早花突變的原因有關(guān)。從紅菜苔中克隆了FLC上游基因FRI的同源基因BrpFRI的起始

9、密碼子附近的一段區(qū)域，這一在擬南芥中經(jīng)常發(fā)生突變導(dǎo)致早花的區(qū)域，在紅菜苔中沒有發(fā)生導(dǎo)致功能喪失的突變。
　　 (8)分析FLC在紅菜苔和白菜中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，在紅菜苔中BrpFLC具有較低水平的表達(dá)。紅菜苔的早花突變與BrpFLC較低水平的表達(dá)具有一定的關(guān)系。
　　 (9)從紅菜苔中克隆了VIN3的同源基因BrpVIN3的一段包括VIN3的PHD和FNⅢ區(qū)序列，并根據(jù)siRNA序列設(shè)計(jì)要求，構(gòu)建了BrpVIN3基因的RN