雞Mx基因表達及其抗體血清制備的研究.pdf

1、Mx蛋白在許多生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，具有廣泛的抗病毒作用和GTP酶水解活性，是Ⅰ型干擾素誘導的蛋白，屬于大分子GTP酶動態(tài)蛋白家族。該蛋白對多種負鏈RNA病毒有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，不同物種及類型的Mx蛋白有不同的抗病毒特異性，并且其在抗病毒機理上也稍有不同。目前，對于該基因的表達、定位及其功能、作用機理的研究主要集中在人、小鼠等哺乳動物上，而對于家禽該基因的研究隨著禽流感的爆發(fā)也日趨成為熱點。本研究通過亞克隆雞Mx基因，構(gòu)建原核表達載體、真核表

2、達載體，實現(xiàn)了該蛋白在不同體外條件下的表達及其抗體血清的制備，為雞Mx蛋白的大量獲取及其功能檢測、作用機理研究奠定基礎，同時也對家禽抗病基因的選擇及抗病品種、轉(zhuǎn)基因群體的制備提供重要的參考。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.雞抗病毒Mx基因在大腸桿菌中的表達、純化和鑒定。研究亞克隆雞Mx基因cDNA序列，通過基因工程方法構(gòu)建pET32a-Mx重組表達載體，并在工程菌Rossetta-gami(DE3)中誘導表達，并對誘導表達條件進行

3、優(yōu)化，以割膠純化方法簡捷獲取純化蛋白，Western blotting鑒定表達產(chǎn)物。研究結(jié)果顯示：雞Mx蛋白在37℃、0.8mmol/L IPTG濃度條件下誘導4小時時，在大腸桿菌中表達量最高。純化和Western blotting鑒定結(jié)果顯示，實現(xiàn)了雞Mx蛋白在大腸桿菌中的融合、高效表達。
　　 2.雞抗病毒蛋白Mx基因在畢赤酵母中的表達研究。研究將編碼雞抗病毒Mx蛋白基因亞克隆至含有分泌信號肽序列的穿梭表達載體中，構(gòu)建成分泌

4、型重組表達載體pPIC9K-Mx。用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115后，篩選出高拷貝重組子。陽性菌株分別經(jīng)0.5％、1％甲醇誘導，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了雞抗病毒蛋白Mx基因穿梭表達載體，并篩選獲得高拷貝菌株。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，在甲醇濃度維持在1％時，雞抗病毒Mx蛋白在畢赤酵母GS115中獲得良好表達，并且外源基因表達蛋白約占上清蛋白總量的39.2％。
　　 3.雞Mx基因組

5、成型AAV-293細胞表達系的建立。本研究將雞Mx基因克隆至pIRES2-EGFP載體，并引入6*His標簽。鑒定正確后，將質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Mx轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，熒光倒置顯微鏡觀察外源基因在細胞水平中的表達情況。并經(jīng)RT-PCR，Western blotting等方法從RNA、蛋白質(zhì)水平鑒定該蛋白在細胞中的表達。結(jié)果顯示，目的基因?qū)崿F(xiàn)了在AAV-293細胞中的表達，為穩(wěn)定表達細胞系的建立奠定基礎。
　　 4.基