雞DAZL基因克隆、原核表達和多克抗體的制備.pdf

1、禽類原始生殖細(xì)胞(primodial germ cells，PGCs)是配子的前體細(xì)胞，可以作為將外源基因轉(zhuǎn)入基因組和生殖系的有效載體，因為PGCs能夠通過血流靶向進入雜合子胚胎性索，將遺傳特性直接傳遞給后代。在體外培養(yǎng)條件下，超表達外源性DAZL的小鼠胚胎干細(xì)胞(Mouse Embryonic StemCells，mESCs)在不形成類胚體的情況下，誘導(dǎo)分化為有活力的精子和卵子；瞬時超表達DAZL的mESCs能抑制Nanog基因表達，

2、但卻能誘導(dǎo)生殖細(xì)胞核抗原表達；DAZL基因沉默導(dǎo)致Stella、Mvh、Prdm1等其它生殖細(xì)胞標(biāo)志基因的表達量下調(diào)。如果將DAZL基因與目的基因體內(nèi)或體外共同導(dǎo)入PGCs，可能會提高這類細(xì)胞的生殖系傳遞能力，從而有助于解決轉(zhuǎn)基因雞效率低下的難題。
　　 1、從7日齡廣西三黃雞睪丸組織抽提總RNA，運用RT-PCR技術(shù)克隆了DAZL基因。實驗結(jié)果表明：三黃雞DAZL基因開放閱讀框由870個核苷酸組成，其編碼289個氨基酸；與Ge

3、nB ank中登記的雞DAZL基因序列同源性達100%。
　　 2、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，三黃雞DAZL基因核苷酸及氨基酸序列與其它有脊椎動物具有較高的同源性。雞DAZL基因與人和牛的核苷酸序列同源性分別為73.5%和73.1％，氨基酸序列同源性則分別為71.5％和71.8%；氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，三黃雞DAZL蛋白與部分已報道的脊椎動物同類蛋白具有保守的RRM結(jié)構(gòu)域和DAZI重復(fù)基序，具有高度的進化保守性。DAZL蛋白系統(tǒng)發(fā)生

4、樹分析表明，雞Dazl基因與其他物種間存在一定的遺傳距離，雖與家鼠、牛和人類同聚為一枝，但之間親緣關(guān)系相對較遠。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，雞DAZL基因氨基酸序列的N端不存在信號肽。
　　 3、擴增的雞DAZL基因亞克隆至原核表達載體pET30a上，成功構(gòu)建了原核表達載體pET30a-DAZL。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)His-DAZL融合蛋白表達，并通過SDS-PAGE和Western blotting加以

5、驗證。利用Ni-NTA argrose介質(zhì)純化His-DAZL融合蛋白，并將其免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，Western blot檢測其抗體的特異性。經(jīng)SDS-PAGE分析表明，His-DAZL融合蛋白在大腸桿菌中得以高效表達，且以包涵體方式表達；應(yīng)用8 mol·L-1尿素溶解包涵體，利用鎳離子金屬螯合親和層析法純化，獲得了高純度His-DAZL融合蛋白；經(jīng)Western Bloting檢測，獲得的雞DAZL多克隆抗體能與His-