浙貝母基因組dna提取方法比較研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　浙貝母基因組DNA提取方法比較研究</p><p><b>　　摘 要</b>&l

2、t;/p><p>　　浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）是用于止咳化痰的常用中藥，是著名的“浙八味”之一，其藥用成分為生物堿。本文分別以取自寧波市鄞州區(qū)章水的狹葉浙貝、寬葉浙貝、多籽浙貝葉片為材料，分別采用CTAB法、SDS法、高鹽低pH法和試劑盒法來(lái)提取浙貝母基因組DNA，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)、PCR擴(kuò)增對(duì)所提取的DNA樣品進(jìn)行純度和濃度及完整性檢測(cè)，以尋找適合浙貝母基

3、因組DNA的提取方法。結(jié)果表明，用高鹽低pH法提取的DNA濃度、純度和完整性都較高，從經(jīng)濟(jì)角度講優(yōu)于試劑盒提取法，是比較適合浙貝母新鮮葉片基因組DNA提取的方法。同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明上述四種方法都不適合浙貝母新鮮鱗莖組織基因組DNA的提取，而用CTAB法提取浙貝母鱗莖干粉基因組DNA的效果相對(duì)較好。由此表明，在進(jìn)行浙貝母分子生物學(xué)研究時(shí)，采用新鮮葉片作為實(shí)驗(yàn)材料為宜。</p><p>　　關(guān)鍵詞：浙貝母；基因組DN

4、A；提取</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　Fritillaria thunbergii Miq. is traditional Chinese medicine used to Cough expectorant, is the one of famous "zhejiang eight flavour",

5、 its medicinal ingredients is alkaloid.The paper based on materials respectively from leaf water 、broad leaf、much seed of Fritillaria thunbergii Miq. in Zhangshui town of Yinzhou, CTAB method,SDS method,high salt low pH

6、method and kit method were used to extract genomic DNA from Fritillaria thunbergii Miq.,and through the agarose gelelectrophoresis, uv spectrophoto</p><p>　　Key words: Fritillaria thunbergii Miq.;Genomic DNA

7、; extraction</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料與方法3</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料3</p><p>　　2.1.1 材

8、料3</p><p>　　2.1.2 主要化學(xué)藥品和試劑3</p><p>　　2.1.3 主要儀器和設(shè)備4</p><p>　　2.1.4 主要試劑及配制方法5</p><p>　　2.1.5 其他材料6</p><p><b>　　2.2 方法6</b></p>&l

9、t;p>　　2.2.1 材料的處理6</p><p>　　2.2.2 浙貝母基因組DNA提取方法6</p><p>　　2.2.3 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)8</p><p>　　2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳8</p><p>　　2.2.5 瓊脂糖凝膠染色成像9</p><p>　　3 結(jié)果與分析10<

10、;/p><p>　　3.1 不同方法對(duì)浙貝母基因組DNA提取質(zhì)量的影響10</p><p>　　3.2 不同品種對(duì)浙貝母基因組DNA提取質(zhì)量的影響12</p><p>　　3.3 不同組織部位對(duì)浙貝母基因組DNA提取質(zhì)量的影響13</p><p>　　3.4 PCR擴(kuò)增13</p><p><b>　　4

11、 討論14</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)15</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　貝母為百合科多年生草本植物的鱗莖，是止咳化痰的一味常用中藥。主要分為川貝母、浙貝母、伊貝母、平貝母和湖北貝母。目前臨床上應(yīng)用的主要是浙貝母和川貝母。浙貝母（Fritilla

12、ria thunbergii Miq.）又稱大貝母、象貝母，浙貝母的鱗莖干燥，性寒、味苦，具有清熱散結(jié)、化痰止咳、開(kāi)郁之功效，是較為常用的中藥材，也是著名的“浙八味”之一[1]。在國(guó)內(nèi)外享有盛譽(yù)。主產(chǎn)于浙江，在安徽、江蘇等地也有產(chǎn)。浙貝母以鱗莖入藥，性寒，味苦、甘，藥用價(jià)值很高，有清熱、潤(rùn)肺、散結(jié)、止咳、化痰等治療功能。是主治虛勞、肺燥、咳痰、咯血、心胸郁結(jié)、肺炎及急慢性支氣管炎等病癥的主要藥物。歷代的記載和近代研究資料表明，浙貝母不僅

13、具有明顯的鎮(zhèn)咳潤(rùn)肺作用，而且對(duì)呼吸系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抑制腺體分泌及散瞳等都有一定作用[2]。</p><p>　　浙貝母性喜溫暖濕潤(rùn)氣候，適宜在10～25℃氣溫中生長(zhǎng)，較耐寒，怕高溫，忌漬水，要求土層深厚，對(duì)土壤質(zhì)地要求嚴(yán)。光照，溫度，水分，土壤質(zhì)地等都會(huì)影響浙貝母的生長(zhǎng)，會(huì)直接的影響浙貝母的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)其藥用成分的形成、積累也會(huì)起到一定的影響[2]。</p><p>　

14、　浙貝母的種類(lèi)包括狹葉浙貝，寬葉浙貝，輪葉浙貝，三芽浙貝，多籽浙貝，東貝母等，目前主要種植栽培的品種是狹葉浙貝，寬葉浙貝和多籽浙貝。狹葉浙貝母又稱細(xì)葉種，原產(chǎn)地象山。株高70～80厘米，莖粗0.6～0.7厘米，莖直立，圓柱形，中空，外側(cè)光滑無(wú)毛，莖桿表面有蠟質(zhì)，主莖基部近地面5～6厘米棕色，6～9厘米為綠色，9厘米以上與葉色相同。主桿上葉節(jié)長(zhǎng)約12.5厘米。地下鱗莖表皮黃白色，呈扁球形，直徑3～6厘米，單個(gè)重40克左右。葉色藍(lán)綠，葉片呈

15、披針形，葉尖卷曲，單葉，全緣，葉長(zhǎng)8～10厘米，下部葉寬0.9厘米，上部葉寬0.65厘米。頂部呈長(zhǎng)條卷曲狀，葉面光滑，有蠟質(zhì)且較厚。鱗莖鮮品畝產(chǎn)1500千克左右，畝產(chǎn)干貝可達(dá)300千克左右。狹葉浙貝是寧波市鄞州區(qū)的主栽品種，栽培面積占當(dāng)?shù)卣阖惸阜N植總面積的90%以上[1]。寬葉浙貝母又稱大葉種，竹葉種，原產(chǎn)寧波市樟村、嶺下、鄞溪一帶，是當(dāng)?shù)氐牡胤狡贩N，株高72～78厘米，莖粗0.62～0.68厘米，莖直立，圓柱形，中空，外側(cè)光滑無(wú)毛，莖

16、桿表面有蠟質(zhì)，主莖基部近地面7～9厘米棕色或棕綠色，9～13厘米為棕綠過(guò)渡色，13厘米以上為綠色。地下鱗莖表皮乳白或奶黃色</p><p>　　眾所周知，基因組DNA的提取是進(jìn)行各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，DNA提取的得率和質(zhì)量也或多或少的對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著影響。它是進(jìn)行任何DNA工作（如PCR、Southern blotting和克隆等）的前提和基礎(chǔ)，也是最關(guān)鍵的一步。不同植物核酸結(jié)合蛋白的情況各不相同，因而要采

17、取不同的提取方法[3-6]。而中藥材中含有更為豐富的次生代謝產(chǎn)物，這些對(duì)DNA的提取都有著不可忽視的影響，所以中藥材的DNA提取困難，有頑拗植物[7]之稱。探索中藥材的DNA提取方法有著重要的意義。目前采用的方法有以下幾種：</p><p>　　（1）十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法</p><p>　　CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中會(huì)因溶解度的

18、降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使DNA和多糖分開(kāi)，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮(PVP)與多酚結(jié)合形成復(fù)合物，從而可有效避免多酚類(lèi)化合物介導(dǎo)的DNA 降解[8]。</p><p><b>　　（2）SDS法</b></p><p>　　為了避免CTAB法試驗(yàn)步驟多、操作繁瑣的不足之處，近年來(lái)又提出了利用SDS2Tris2Cl-2EDT

19、A等直接裂解細(xì)胞使其釋放出DNA的方法[9]。在該法后續(xù)的DNA純化過(guò)程中通常采用酚/氯仿處理，但對(duì)于植物DNA純化不是一個(gè)很好的選擇，因?yàn)榉拥氖褂每山档虳NA的提取效率和純度。</p><p><b>　?。?）氯化芐法</b></p><p>　　李思光等[10]在對(duì)獼猴桃的基因組DNA提取過(guò)程中選用了氯化芐法，與其他方法相比該法的得率較高，其原因可能是氯化芐不僅

20、可與植物細(xì)胞壁上的多糖羥基反應(yīng)生成醚，而且與細(xì)胞液中多糖物質(zhì)的羥基反應(yīng)，起到破壞糖鏈的作用，利于DNA的釋放和提純。</p><p>　?。?）高鹽低pH法[11]</p><p>　　該法中所用的提純?cè)噭﹥H為無(wú)機(jī)鹽和異丙醇。通常采用的無(wú)機(jī)鹽為醋酸鉀，低pH的醋酸鉀是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑。與一般氯仿-異丙醇反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)的操作相比該法操作更方便省時(shí)，所需樣品量少，適用于瀕危植物DNA的提

21、取。</p><p><b>　　（5）果膠酶法</b></p><p>　　Steven等[12]采用果膠酶對(duì)植物細(xì)胞破碎后的抽提混合物進(jìn)行消化處理使與DNA共沉淀的膠狀物質(zhì)分解成小的片段，從而無(wú)法與DNA一起沉淀下來(lái)，降低了DNA 的純化難度，提高純化效率。</p><p>　　（6）DNA試劑盒法</p><p>

22、　　DNA試劑盒法是實(shí)驗(yàn)室快速少量提取高純度DNA的一種方法。由于其適用于多個(gè)樣品同時(shí)操作，快速，準(zhǔn)確，方便，無(wú)需酚等抽提，避免了有機(jī)質(zhì)溶劑的污染，并且不含PCR反應(yīng)抑制藥及其他酶反應(yīng)抑制藥，可被各種限制性內(nèi)切酶完全降解，在科研中的地位慢慢開(kāi)始受到重視。</p><p>　　本文在浙江寧波鄞州區(qū)章水、龍觀、鄞江、金華磐安等地分別采集了相同品種的浙貝母鱗莖，在鄞州區(qū)的章水采集了狹葉浙貝、寬葉浙貝、多籽浙貝三個(gè)不同品

23、種的浙貝母的地上莖及葉。采用多種方法從中藥材浙貝母的新鮮葉片中提取基因組DNA，并且對(duì)這些方法進(jìn)行比較，從中找出更為適宜的簡(jiǎn)單易操作的方法。這個(gè)研究也為開(kāi)展浙貝母種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析以及分子鑒定奠定了基礎(chǔ)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料</b></p><

24、p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)所用的狹葉品種浙貝母鱗莖分別采自浙江省寧波鄞州區(qū)章水鎮(zhèn)、龍觀鄉(xiāng)、鄞江鎮(zhèn)，金華磐安縣。寬葉浙貝、狹葉浙貝、多籽浙貝三個(gè)品種的浙貝母地上莖、葉采自鄞州區(qū)章水鎮(zhèn)。各對(duì)照樣品均取自同一采收時(shí)間。樣品均鑒定無(wú)誤。</p><p>　　2.1.2 主要化學(xué)藥品和試劑</p><p>

25、　　表1 主要化學(xué)藥品和試劑</p><p>　　2.1.3 主要儀器和設(shè)備</p><p>　　表2 主要儀器和設(shè)備</p><p>　　2.1.4 主要試劑及配制方法</p><p>　?。?）Tris-HCl(1M)：稱量121.1gTris置于1L燒杯中，加入800uL去離子水充分?jǐn)嚢枞芙?，加濃鹽酸調(diào)節(jié)所需pH值，定容至1L高壓滅

26、菌后，室溫保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　?。?）EDTA（0.5M，pH8.0）：稱取186.1gNa2EDTA2H2O置于1L燒杯中，加入約800uL去離子水充分?jǐn)嚢?，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0時(shí)，EDTA才能完全溶解（約加200gNaOH），加去離子水將溶液定容至1L，適量分成小份后高壓滅菌室溫保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　?。?）TE緩沖液：5mL Tris-HCl(1M)，1mL

27、 EDTA（0.5M，pH8.0）,再加400mL Deionized water混合，最后定容至500mL備用。</p><p>　　（4）Marker（現(xiàn)配現(xiàn)用）：1μL DNA Ladder，1μL 6X Loading Dye Solution，4μL Deionized water，混合均勻；</p><p>　?。?）TBE緩沖液（10×）：稱取Tris108g，硼酸

28、55g，EDTA（0.5M，pH=8.0）40mL，用水定容到1000mL，作為10×的貯存液。稀釋到10倍后作為工作液使用；</p><p>　?。?）70%乙醇溶液：量取無(wú)水乙醇70mL，然后加去離子蒸餾水30mL，混合均勻。</p><p>　?。?）CTAB提取緩沖液：稱取CTAB 5g，NaCl 20.455g，Tris-HCl(1M，pH=8.0)25mL，EDTA（

29、0.5M，pH=8.0）10mL，先用200mL Deionized water溶解，再定容至250mL。高壓滅菌后，室溫保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　（8）SDS提取緩沖液：稱取SDS 1.5g，Tris-HCl(1M)10mL，EDTA（0.5M，pH=8.0）10mL,NaCl 2.925g，再加入70mLDeionized water溶解（需加熱溶解），定容至100mL高壓滅菌后，室溫保存?zhèn)溆谩?lt;

30、/p><p>　?。?）按瓶身標(biāo)簽說(shuō)明在Wash Solution中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后在瓶身做好標(biāo)記。于室溫密封保存。每次使用后將瓶蓋蓋緊，以保持Wash Solution中的乙醇含量。若Wash Solution由于運(yùn)輸或保管不當(dāng)造成容量不準(zhǔn)，請(qǐng)用量筒定容后再加入相應(yīng)體積的無(wú)水乙醇。</p><p>　　（10）PW Solution在使用前加入12mL(SK1203)或24mL

31、(SK1204)的異丙醇。</p><p>　?。?1）PB Solution在使用前加入25mL(SK1203)或50mL(SK1204)的無(wú)水乙醇。PB Solution在低溫下可能產(chǎn)生沉淀，使用前請(qǐng)檢查，如有沉淀，請(qǐng)于37°C溶解沉淀，待冷卻至室溫后使用。</p><p>　　2.1.5 其他材料</p><p>　　1.5mL離心管、1mL;槍頭、

32、200uL槍頭、10uL;小槍頭、100mL量筒、500mL量筒、1000mL量筒、100mL容量瓶、250mL容量瓶、500mL容量瓶、100mL燒杯、250mL燒杯100mL試劑瓶、250mL試劑瓶、500mL試劑瓶、1000mL試劑瓶、ddH2O、蒸餾水、手術(shù)剪刀、一次性手套、一次性橡膠手套、透明膠帶、稱量紙、擦鏡紙、溴酚藍(lán)、溴化乙錠（EB）。</p><p><b>　　2.2 方法</b

33、></p><p>　　2.2.1 材料的處理</p><p>　　葉片的處理：將新鮮葉片洗凈擦干后剪碎，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的PVP提取液以及2%的β-巰基乙醇進(jìn)行快速研磨。研磨成均勻的糊狀后取適量分裝入1.5mL的Eppendorf管中。</p><p><b>　　鱗莖的處理：</b></p><p>

34、　?。?）將鱗莖去皮洗凈后切成細(xì)小的狀塊（冰上進(jìn)行），放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的PVP提取液以及2%的β-巰基乙醇進(jìn)行快速研磨。研磨成均勻的糊狀后取適量分裝入1.5mL的Eppendorf管中。</p><p>　　（2）將鱗莖去皮洗凈后烘干，用萬(wàn)能粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉狀。用時(shí)，稱取適量到Eppendorf管中。</p><p>　　2.2.2 浙貝母基因組DNA提取方法</p>

35、<p>　　2.2.2.1 CTAB法</p><p>　　CTAB提取法參照Dellaporta等和Saghai-Maroof等的方法進(jìn)行，其步驟如下：</p><p>　?。?）加入800μL預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，混勻后65℃水浴1h，12000rpm離心15min；</p><p>　?。?）取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）輕輕混

36、勻，12000rpm離心15min，重復(fù)此步驟一次；</p><p>　?。?）取上清，加入2/3體積的異丙醇，放入-20℃冰箱40min，沉淀DNA；</p><p>　?。?）加入200μL70%乙醇洗滌DNA2-3次；</p><p>　?。?）將1.5 mLEppendorf管倒置于通風(fēng)柜里，使DNA盡量干燥；</p><p>　?。?/p>

37、6）加入適量的TE，溶解DNA；</p><p>　?。?）置于4℃冰箱保存，備用。</p><p>　　2.2.2.2 SDS法</p><p>　?。?）加入800μL預(yù)熱的SDS提取緩沖液，混勻后65℃水浴1h，12000rpm離心15min；</p><p>　　（2）取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）輕輕混勻，12000r

38、pm離心15min，重復(fù)此步驟一次；</p><p>　?。?）取上清，加入2/3體積的異丙醇，放入-20℃冰箱40min，沉淀DNA；</p><p>　?。?）加入200μL70%乙醇洗滌DNA2-3次；</p><p>　?。?）將1.5 mLEppendorf管倒置于通風(fēng)柜里，使DNA盡量干燥；</p><p>　?。?）加入適量的T

39、E，溶解DNA；</p><p>　?。?）置于4℃冰箱保存，備用。</p><p>　　2.2.2.3 高鹽低pH法</p><p>　　（1）加入800μL預(yù)熱的提取緩沖液A（100mmol/L醋酸鈉，50mmol/LEDTA, 500m mol/L氯化鈉,2.5%PVP,3%SDS,pH=5.5），56℃水浴30min；</p><p>

40、;　?。?）10000rpm離心10min，取上清加入2/3體積的2.5mol/L醋酸鉀溶液，4℃放置15min；</p><p>　?。?）10000rpm離心10min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）輕輕混勻，10000rpm離心10min,重復(fù)此步驟一次；</p><p>　　（4）取上清，加入2/3體積的異丙醇，放入-20℃冰箱40min，沉淀DNA；</p&g

41、t;<p>　　（5）加入200μLl70%乙醇洗滌DNA2-3次</p><p>　?。?）將1.5 mLEppendorf管倒置于通風(fēng)柜里，使DNA盡量干燥；</p><p>　?。?）加入適量的TE，溶解DNA；</p><p>　?。?）置于4℃冰箱保存，備用。</p><p>　　2.2.2.4 試劑盒法</p&

42、gt;<p>　　上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式植物基因組抽提試劑盒。抽提步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)所示。</p><p>　?。?）將50-100mg的新鮮幼嫩植物組織在液氮中充分研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中。（此步驟很關(guān)鍵。研磨是否充分，將會(huì)影響基因組的得率。研磨充分標(biāo)準(zhǔn)是在加入PCLSolution后，在溶液中沒(méi)有大的組織團(tuán)塊。樣品盡量不要采用植物的微管組織。）</p

43、><p>　?。?）依次加入400μLPCL Solution和4μLβ-巰基乙醇。震蕩混勻1min，置于65°C水浴20 min。</p><p>　?。?）加入130μLPP Solution，上下顛倒混勻3-5次，然后將其置于冰上放置10min。12,000rpm離心10min。（此時(shí)會(huì)產(chǎn)生沉淀，如果上清仍有懸浮的顆粒，請(qǐng)用槍頭除去。）</p><p>

44、　?。?）吸取上清至一個(gè)干凈的1.5mL的離心管中,加入40μLRNaseA（20mg/mL），混勻，室溫放置10min。</p><p>　?。?）加入1.5倍體積的PBSolution，上下顛倒混勻2-3次。（PB Solution使用前請(qǐng)檢查是否按比例加入無(wú)水乙醇?？赡墚a(chǎn)生白色沉淀，70°C水浴10分鐘沉淀會(huì)消失，如果溶液還沒(méi)有澄清，說(shuō)明裂解不徹底，會(huì)降低基因組DNA的提取量和DNA純度。可能會(huì)產(chǎn)

45、生半透明纖維狀懸浮物（為基因組），不影響DNA的提取和應(yīng)用。）</p><p>　?。?）用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入到吸附柱中，室溫靜置2min。10000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液。</p><p>　?。?）將吸附柱放回收集管中，加入500μL PW Solution，10000rpm離1min，倒掉收集管中廢液。（PW Solution使用前請(qǐng)檢查溶液是否按

46、比例加入異丙醇。）</p><p>　?。?）將吸附柱放回收集管中，加入500μL Wash Solution，10,000rpm離1min，倒掉收集管中廢液。（Wash Solution使用前請(qǐng)檢查溶液是否按比例加入無(wú)水乙醇。）</p><p>　?。?）將吸附柱放回收集管中，10000rpm離心2min。（此步絕不可省略，否則殘余的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響得率和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。）</p>

47、<p>　　（10）將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50μL預(yù)熱（60°C）的Elution Buffer，靜置5min，10000rpm離心1min，將所到的DNA溶液置于-20°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。（Elution Buffer為2.5mM Tris-HCl，pH8.5，可以用TE或水（pH>7.0）代替。將Elution Buffer預(yù)熱至60°C可以進(jìn)一步提

48、高得率。請(qǐng)勿使用小于40μL的洗脫液進(jìn)行洗脫。）</p><p>　　2.2.3 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)</p><p>　　將紫外分光光度計(jì)預(yù)熱半小時(shí)，以無(wú)菌水作為空白值，取10μLDNA樣品液用TE稀釋至300μL，混勻后測(cè)定其在260nm和280nm紫外光下的吸收值和DNA的濃度。</p><p>　　2.2.4 瓊脂糖凝膠電泳</p><p&

49、gt;　　2.2.4.1 瓊脂糖凝膠制備</p><p>　　將10×TEB稀釋成1×TEB備用。稱取1.0g瓊脂糖于250mL三角瓶中，加入1100mL1×TEB緩配制成1%的瓊脂糖凝膠，將其在微波爐中加熱至完全溶解，在距底板0.5~1.0mm的位置上放置梳子，將溫?zé)岬沫傊悄z倒入膠才槽中，凝膠厚度在3~5mm之間，等到凝膠充分冷卻后，向其到入少許緩沖液。其目的是為了起到潤(rùn)滑的作

50、用，以免在拔梳子時(shí)將凝膠弄破。在拔梳子時(shí)，一定要注意雙手用力均勻。</p><p>　　2.2.4.2 點(diǎn)樣</p><p>　　點(diǎn)樣時(shí)，將移液器基本垂直點(diǎn)樣孔，用另一只手幫助固定移液器下端，移液器槍頭（Tip）尖端進(jìn)入點(diǎn)樣孔即可將樣品注入孔內(nèi)，千萬(wàn)不可將Tip尖插至孔底，并點(diǎn)上Marker（標(biāo)準(zhǔn)DNA）作為指示。</p><p>　　注：本實(shí)驗(yàn)中樣品DNA點(diǎn)樣量為

51、5.5μL（5μL樣品DNA1μL溴酚藍(lán)混合均勻取其中5.5μL點(diǎn)樣）；Marker點(diǎn)樣量為6μL（1μL DNA Ladder，1μL 6X Loading Dye Solution，4μL Deionized water）。</p><p>　　2.2.4.3 電泳</p><p>　　將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連，負(fù)極與負(fù)極相連，DNA帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。調(diào)準(zhǔn)電壓為7V/

52、cm左右（小膠約100V左右，大膠約140V左右），電泳時(shí)間為50-60min（以溴酚藍(lán)指示劑為準(zhǔn)）。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應(yīng)相同，電泳緩沖液以剛好沒(méi)過(guò)凝膠1 mm為好。</p><p>　　2.2.5 瓊脂糖凝膠染色成像</p><p>　　溴化乙錠（EB）是一種嵌入型染料，其上的一個(gè)扁平的基團(tuán)可插入到DNA或RNA鏈的堆積堿基之間。溴化乙錠的嵌入基團(tuán)與堿基的接近使二者緊密

53、結(jié)合。DNA吸收254nm的紫外輻射并傳遞能量給EB，而EB本身在302nm和366nm處有光吸收。吸收的能量在590nm處釋放，并表現(xiàn)為橙紅色熒光。結(jié)合的EB的熒光產(chǎn)率遠(yuǎn)大于游離EB的熒光產(chǎn)率。EB結(jié)合量的多少與DNA的大小和構(gòu)型有關(guān)，而熒光強(qiáng)度正比于嵌入溴化乙錠的量。對(duì)于單一構(gòu)型的同種DNA樣品來(lái)說(shuō)，溴化乙錠的嵌入量與樣品溶液的DNA含量成正比。</p><p>　　將凝膠置于轉(zhuǎn)移脫色搖床上用EB染色半小時(shí)左

54、右，回收染色液，凝膠用清水清洗兩至三次后，小心移入凝膠成像設(shè)備中，調(diào)整大小清晰度，成像、攝影。注意：EB具有中度毒性、強(qiáng)致癌性，操作時(shí)切記戴手套，切勿沾染到衣物、皮膚、眼晴、口鼻等。沾有EB的用具使用完畢統(tǒng)一集中于回收容器中，經(jīng)凈化處理后方可棄。</p><p><b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸

55、收，其吸收峰在260nm處。波長(zhǎng)為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)說(shuō)，濃度為1μg/mL時(shí)，DNA鈉鹽的OD260＝0.02。當(dāng)OD260＝1時(shí)，dsDNA濃度約為50μg/mL；ssDNA濃度約為37μg/mL；RNA濃度約為40μg/mL；寡核苷酸濃度約為30μg/mL（由于底物不同有差異）。</p><p>　　當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他

56、小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。</p><p><b>　　經(jīng)驗(yàn)值：</b></p><p>　　純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）；</p><p>　　純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時(shí)表明可能有異

57、硫氰酸殘存）。</p><p>　　可以據(jù)此來(lái)計(jì)算核酸樣品的濃度,還可通過(guò)測(cè)定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估計(jì)核酸的純度。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。紫外分光光度法只能用于測(cè)定濃度大于0.25μg/mL的核酸溶液，對(duì)濃度更小的樣品，可采用熒光分光光度法。</p><p>　　3.1 不同方法對(duì)浙貝母基因組DNA提取質(zhì)量的影響</p>

58、<p>　　本實(shí)驗(yàn)選取了浙貝母多籽品種葉片為材料進(jìn)行基因組DNA提取方法的比較研究。結(jié)果如圖1和表3所示。</p><p>　　如上表3所示，從DNA溶液濃度上看，CTAB法得到的DNA濃度范圍在26~70.45μg/mL，SDS法得到的DNA濃度范圍在15.6~69.75μg/mL， 高鹽低pH法得到的DNA濃度范圍在9.083~22μg/mL，試劑盒法得到的DNA濃度范圍在10~14μg/mL。

59、即，CTAB法和SDS法提取出的DNA得率普遍較高。</p><p>　　從DNA溶液純度上看，高鹽低pH和試劑盒法得到的260/280（OD）值在1.8~1.9左右，而CTAB法得到的比值是在2.103~2.5，SDS法得到的比值是在1.63~1.945。 根據(jù)純的DNA其260/280（OD）值應(yīng)該≥1.8，純的RNA其260/280值應(yīng)≥2.0，得出高鹽低pH和試劑盒法提出的DNA純度較高，CTAB法得到基

60、因組DNA的含RNA較高，SDS法得到蛋白和糖較多的基因組DNA。若選擇后兩種方法提取DNA，為了保證質(zhì)量，還要適當(dāng)?shù)募尤隦Nase酶和蛋白酶K。</p><p>　　圖1 不同方法提取的浙貝母基因組DNA電泳圖</p><p>　　1~2 CTAB法 3~5 SDS法 6~8高鹽低pH法 9~11試劑盒法</p><p>　　表3 不同提取方法對(duì)浙貝

61、母DNA質(zhì)量的影響</p><p><b>　　注：稀釋30倍后</b></p><p>　　3.2 不同品種對(duì)浙貝母基因組DNA提取質(zhì)量的影響</p><p>　　本試驗(yàn)還采用高鹽低pH法分別提取了狹葉、寬葉和多籽三個(gè)浙貝母品種的基因組DNA，結(jié)果見(jiàn)如圖2和表4所示。</p><p>　　圖2 不同品種提取的浙貝母基

62、因組DNA電泳圖</p><p>　　1~4多籽 5~8狹葉 9~12寬葉</p><p>　　表4 不同品種對(duì)浙貝母DNA提取質(zhì)量的影響</p><p><b>　　注：稀釋30倍</b></p><p>　　由表4可見(jiàn)，不同品種中提取的基因組DNAOD260/280比值均在1.81~1.97之間，且含量也穩(wěn)

63、定在6.7~15.2之間，由此表明，采用高鹽低pH法可提取各種不同基因型的浙貝母基因組DNA。</p><p>　　3.3 不同組織部位對(duì)浙貝母基因組DNA提取質(zhì)量的影響</p><p>　　由于以葉片為實(shí)驗(yàn)材料有時(shí)間局限性，但是鱗莖是常年易取的實(shí)驗(yàn)材料所以本實(shí)驗(yàn)選取了用浙貝母多籽品種新鮮鱗莖、葉片、鱗莖粉末為實(shí)驗(yàn)材料提取DNA，結(jié)果如圖3所示。</p><p>　

64、　圖3 不同組織部位提取的浙貝母基因組DNA電泳圖</p><p>　　1~5新鮮鱗莖 6~9浙貝母葉片 10~13鱗莖粉末</p><p>　　如上圖所示，用新鮮鱗莖作為實(shí)驗(yàn)材料沒(méi)有提出DNA，這表明基因組DNA均是降解嚴(yán)重或是沒(méi)有根本沒(méi)有提出來(lái)。這可能是因?yàn)樵陂_(kāi)始實(shí)驗(yàn)的切碎的過(guò)程中DNA的就大量的降解了。另外，鱗莖類(lèi)植物富含多糖類(lèi)等儲(chǔ)藏性成分，而中藥材中也是富含次生代謝產(chǎn)物，這些都

65、很大的增加提取DNA的難度。這些可能導(dǎo)致鮮鱗莖基因組DNA提的效果極差。用鱗莖粉末提取出的DNA拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重的，但是還是可以看到基因組DNA的條帶，這是因?yàn)閷Ⅶ[莖經(jīng)過(guò)烘干后用萬(wàn)能粉碎機(jī)的研磨，降解依舊無(wú)法避免，但是已經(jīng)是將降解盡可能的減少了。在最后加入TE時(shí)，可以看到管底有微量不溶物質(zhì)，可能是多酚污染。用葉片為實(shí)驗(yàn)材料提取出的DNA沒(méi)有拖尾條帶也較量。由此表明，在進(jìn)行浙貝母分子生物學(xué)研究時(shí)，采用新鮮葉片作為實(shí)驗(yàn)材料為宜。</p&

66、gt;<p><b>　　3.4 PCR擴(kuò)增</b></p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選取了用高鹽低pH以及試劑盒法提取的DNA進(jìn)行非特異性PCR擴(kuò)增，隨機(jī)引物選取文獻(xiàn)中出現(xiàn)的S314 ACAGGTGCTG（由上海生工合成），得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)。結(jié)果得到的電泳圖如圖4所示。</p><p>　　圖4 高鹽低pH法及試劑盒法提取的DNA

67、非特異性PCR擴(kuò)增圖</p><p>　　1~5高鹽低pH法 6~9試劑盒法</p><p>　　由圖4可以看到條帶清晰，這說(shuō)明此兩種方法得到的基因組DNA質(zhì)量好，能較好的滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)過(guò)程的需要。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　藥用植物一般都是含有各種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物

68、，一些小分子次生代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、黃酮、萜類(lèi)等含有酚羥基的化合物，氧化后易于和DNA結(jié)合，從而使DNA降解或者會(huì)抑制酶的活性，而植物中的多糖類(lèi)也在提取過(guò)程中難以去除干凈，會(huì)影響到下一步的PCR等過(guò)程。有針對(duì)性的選擇合適的提取DNA方法，可以有效的去除或者是減少干擾因素，使得所需的DNA更加適合后續(xù)的處理過(guò)程。因此，提取DNA方法研究非常重要。CTAB法是常用的提取DNA的經(jīng)典方法，可以有效的裂解植物的細(xì)胞壁。這個(gè)方法比較適合提取新鮮樣品

69、，但是提取步驟多會(huì)影響得率。SDS法對(duì)含有多糖較多的材料不太適合。高鹽低pH法，能有效防止酚化合物的進(jìn)一步氧化，提取的DNA純度好，得率高。從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看，對(duì)于新鮮葉片來(lái)說(shuō)，高鹽低pH法以及試劑盒法，更適合對(duì)于實(shí)驗(yàn)材料-浙貝母新鮮葉片的DNA提取。從提取出DNA的質(zhì)量看，這兩種方法得到的DNA純度好，雜質(zhì)少，質(zhì)量高。從非特異性PCR擴(kuò)增得到的結(jié)果來(lái)看此兩種方法提取得到的DNA能滿足PCR擴(kuò)增的需要。從鱗莖的兩種處理來(lái)看，只有將鱗莖研磨成干

70、粉后，用CTAB法進(jìn)行提取才能得到可用的基因組DNA，但是這種方法使得提取的D</p><p>　　要想獲得質(zhì)量較好的基因組DNA，提取方法的探索很有必要，但是還是不充分的，還需要對(duì)提取步驟中的一些條件進(jìn)行再優(yōu)化，比如β-巰基乙醇的濃度和提取液以及樣本的量的相互關(guān)系的研究、優(yōu)化等等。這些具體的操作步驟一些處理和優(yōu)化都有待于進(jìn)一步的探索。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)<

71、;/b></p><p>　　[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,2001:156-157.</p><p>　　[2] 葉培根,崔培章,張林苗編著.浙貝母[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004:21-53.</p><p>　　[3] 劉萍,代紅軍,張立杰等.DNA 提取方法與植物種類(lèi)的效應(yīng)比較[J].寧夏農(nóng)林科技,1

72、998(1):5-18.</p><p>　　[4] 姚慶收,劉秀珍,武玉永等.草藥干品和新品基因組總DNA提取及質(zhì)量比較研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(6):1570-1572.</p><p>　　[5] 陳莉,魏莉,周童等.幾種中藥DNA提取方法的比較研究[J].廣西植物,2007,27（1）:137-139.</p><p>　　[6] 李軍,郭晏

73、海,黨琳.幾種藥用植物DNA提取與純化方法的比較[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002,25(5):72-73.</p><p>　　[7] 崔培章.五種浙貝母的光合強(qiáng)度及干物質(zhì)生物堿積累動(dòng)態(tài)的研究[J].中藥材,1993,16(6):4-7.</p><p>　　[8] Kim CS ,Lee CH,Shin J S,et al.Simple and rapid method for is

74、olation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP [J]. Nucleic Acids Res,1997,25(5):1085-1086.</p><p>　　[9] 邱國(guó)華,徐增學(xué),曹吉祥等.一種簡(jiǎn)便實(shí)用的提取植物DNA的方法[J].植物生理學(xué)通訊,1997,33(5):368-369.</p>

75、<p>　　[10] 李思光,羅玉萍,陳萬(wàn)秋等.獼猴桃基因組DNA的提取及其RAPD擴(kuò)增研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版),2001,25(3):264-268.</p><p>　　[11] 肖婷婷,朱艷,葉波平等.鳶尾屬藥用植物總DNA提取方法的比較研究[J].中國(guó)野生植物資源,2010,29(3):46-50.</p><p>　　[12] Steven H, Rogsta