蚜蟲(chóng)基因組dna提取方法的改進(jìn)

1、蚜蟲(chóng)基因組DNA提取方法的改進(jìn)3楊子祥陳曉鳴33馮穎繆迎春(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所云南昆明650224)MethodimprovementfextractiongenomicDNAfromaphids.YANGZi2XiangCHENXiao2Ming33FENGYingMIAOYing2Chun(ResearchInstituteofResourceInsectsChineseAcademyofFestryKunmingYu

2、nnan650224China)AbstractThetraditionalSDSmethodwasmodifiedftheisolationofthegenomicDNAfromaphidswithsmallbodysurfacecoveredbyexoskeleton.ComparedwiththetraditionalSDSmethodthissimpleeffectivemethodavoidsgrindingtissueiss

3、uitableftheextractionofDNAfromsingleaphid.GenomicDNApreparedbythisnewmethodissuitablefPCRamplificationusingRAPDromprimerssequencingprimers.KeywdsaphidgenomicDNAextractionimprovement摘要蚜蟲(chóng)基因組DNA的提取是蚜蟲(chóng)分子生物學(xué)研究中的難點(diǎn)。參照動(dòng)物基因組DNA的

4、提取方法根據(jù)蚜蟲(chóng)體型微小體表有外骨骼的特點(diǎn)對(duì)SDS法作了改進(jìn)。改進(jìn)的方法無(wú)需用組織搗碎棒破碎蟲(chóng)體操作簡(jiǎn)便。與現(xiàn)在常用的提取方法相比改進(jìn)的SDS法能快速、有效地提取單頭蚜蟲(chóng)的基因組DNA適用于RAPD隨機(jī)引物和測(cè)序引物的PCR擴(kuò)增。關(guān)鍵詞蚜蟲(chóng)基因組DNA提取方法改進(jìn)3科技部基礎(chǔ)性研究項(xiàng)目(2000DEB100035)。33通訊作者收稿日期:2005212227修回日期:2006201212運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)從核酸水平研究昆蟲(chóng)的分類(lèi)和鑒定、

5、生物型的識(shí)別、遺傳多樣性分析等是現(xiàn)代昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)和昆蟲(chóng)遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)之一開(kāi)展這類(lèi)研究的基礎(chǔ)工作是基因組DNA的提取[1]。在昆蟲(chóng)分子遺傳學(xué)研究中由于研究的樣本量較大除了要獲得質(zhì)量和數(shù)量合乎要求的DNA外還需要提取方法簡(jiǎn)便易行容易掌握成本較低[2]。蚜蟲(chóng)是一類(lèi)分布廣寄主廣泛經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的昆蟲(chóng)世界上已知種類(lèi)為4000多種[3]我國(guó)已報(bào)道的種類(lèi)1000余種[4]。蚜蟲(chóng)大多數(shù)是害蟲(chóng)它們刺吸植物汁液直接影響植物生長(zhǎng)同時(shí)間接傳播病毒病害造成農(nóng)業(yè)

6、上的損失如棉蚜Aphisgossypii、麥長(zhǎng)管蚜Macrosiphumavenae等少數(shù)種類(lèi)如五倍子蚜蟲(chóng)(倍蚜)是重要的資源昆蟲(chóng)具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。蚜蟲(chóng)身體微小形態(tài)特征不顯著生活習(xí)性復(fù)雜并具有多型多態(tài)現(xiàn)象在分類(lèi)和鑒定、近緣種的識(shí)別等方面?zhèn)鹘y(tǒng)的研究方法往往難以發(fā)揮作用[6]。分子遺傳標(biāo)記具有穩(wěn)定性高、受環(huán)境條件影響小信息含量豐富等優(yōu)點(diǎn)非常適合于蚜蟲(chóng)的研究[7]。蚜蟲(chóng)基因組DNA的提取是開(kāi)展蚜蟲(chóng)分子遺傳學(xué)研究的難點(diǎn)Black等采用了

7、SDS法提取蚜蟲(chóng)基因組DNA并用于RAPD擴(kuò)增[8]楊效文等在煙蚜Myzuspersicae(Sulzer)的研究中采用KAC法提取煙蚜的DNA[9]安瑞生等對(duì)KAC法做了改進(jìn)[10]以后的蚜蟲(chóng)研究人員大多采用這種方法[11]。近十幾年來(lái)蚜蟲(chóng)分子生物學(xué)研究有了較大的發(fā)展但對(duì)蚜蟲(chóng)DNA提取方法進(jìn)行探索和比較的研究較少。本試驗(yàn)嘗試和比較了上述幾種方法并以動(dòng)物基因組DNA的提取方法為基礎(chǔ)[12]根據(jù)蚜蟲(chóng)體型微小體表有幾丁質(zhì)外骨骼的特點(diǎn)對(duì)SDS

8、法作了改進(jìn)改進(jìn)的方法無(wú)需用組織搗碎棒破碎蟲(chóng)體操作簡(jiǎn)便能快速、有效地提取單頭和多頭蚜蟲(chóng)的基因組DNA。088昆蟲(chóng)知識(shí)ChineseBulletinofEntomology200643(6)B(KAC3molΠLpH=712)冰上放置1h以上12000rΠmin離心10min取上清液。加入240μLTris飽和酚混勻12000rΠmin離心10min取上清液。加入200μL冷無(wú)水乙醇(預(yù)置于20℃)20℃度冰箱內(nèi)放置1h以上。12000rΠ

9、min離心15min傾去上清液。加入100μL冷的70%乙醇(預(yù)置于7℃)12000rΠmin離心10min傾去上清液。自然干燥后加入20μLddH2O溶解。114DNA濃度和純度檢測(cè)采用1%的瓊脂糖88V(4VΠcm)上樣量為每孔210μL電泳70min0105%EB染色紫外燈下觀(guān)察、照相和分析。用GeneRuler100bpDNALadderPlus作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)并用λDNA(50ngΠμL)估算分子量大小。用核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定

10、OD260和OD260Π280。115PCR擴(kuò)增選用RAPD隨機(jī)引物S7(5′2GGTGACGCAG23)、S118(5′2GAATCGGCCA23′)和EF1α、線(xiàn)粒體COⅡ基因測(cè)序引物對(duì)所提取的模板DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL其中含1buffer215mmolΠLMgCl2015mmolΠLdNTP2UTaq酶66ng引物1μL模板DNA加入ddH2O至20μL。反應(yīng)條件為:94℃5min后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)即94℃1m

11、in、36℃1min、72℃2min最后于72℃延伸10min保存于4℃。測(cè)序引物的反應(yīng)體系同上反應(yīng)條件為:95℃4min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)即94℃1min、51℃1min、72℃1min最后于72℃延伸10min保存于4℃。將擴(kuò)增后的DNA在115%的瓊脂糖凝膠上電泳上樣量為每孔210μL電壓為66V(3VΠcm)時(shí)間為90min電泳緩沖液為1TBE。0105%EB染色紫外燈下觀(guān)察、照相和分析。用GeneRuler100bpDNALad

12、derPlus作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果與分析211不同方法提取基因組的檢測(cè)結(jié)果21111SDS法:5種倍蚜均獲得了DNADNA電泳條帶基本呈線(xiàn)形但有時(shí)會(huì)在DNA帶的前面出現(xiàn)少量拖尾。與λDNA對(duì)照DNA分子量大小約為48kb結(jié)構(gòu)較為完整。核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測(cè)結(jié)果:OD260Π280介于116～118之間可見(jiàn)DNA內(nèi)含有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)DNA的濃度因蟲(chóng)體的大小不同有較大差異一般介于25～100ngΠμL平均濃度為60ngΠμL。2111

13、2改進(jìn)的SDS法:5種倍蚜均獲得了DNADNA電泳條帶基本呈線(xiàn)形無(wú)明顯拖尾(圖1)。與λDNA對(duì)照DNA分子量大小約為48kb結(jié)構(gòu)較為完整。核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測(cè)結(jié)果:OD260Π280介于118～210間可見(jiàn)DNA內(nèi)的含有一定量的RNADNA的濃度介于20～50ngΠμL之間平均濃度為40ngΠμL。RNA對(duì)PCR擴(kuò)增影響不大如果想去除RNA可在DNA溶解液中加入RNAase處理。圖1改進(jìn)的SDS法提取的DNA電泳圖譜M.分子量標(biāo)準(zhǔn)λ.

14、λDNA(48kb)1～5.不同倍蚜的總DNA21113KAC法:DNA電泳圖譜沒(méi)有聚成條帶有時(shí)出現(xiàn)少量拖尾說(shuō)明此法提取的DNA量很少雜質(zhì)較多。核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測(cè)結(jié)果:OD260Π280介于114～117之間表明DNA含量低并且含有較多的蛋白質(zhì)和酚(表2)。212PCR擴(kuò)增結(jié)果21211RAPD隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增:用引物S118擴(kuò)增SDS法提取的DNA得到了豐富的多288昆蟲(chóng)知識(shí)ChineseBulletinofEntomology