超臨界co2萃取枇杷葉中熊果酸的研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　超臨界CO2萃取枇杷葉中熊果酸的研究</p><p><b>　　摘 要</b>

2、;</p><p>　　本文對(duì)超臨界CO2萃取枇杷葉中的熊果酸進(jìn)行了研究，考察了萃取溫度、萃取時(shí)間、萃取壓力3個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果的影響。采用響應(yīng)面法(RSM 法)優(yōu)化枇杷葉熊果酸的提取條件。用高效液相色譜法測(cè)定枇杷葉提取物中熊果酸的含量，利用中心組合設(shè)計(jì)，研究以上3 個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值熊果酸得率的影響。結(jié)果表明：超臨界CO2法萃取枇杷葉熊果酸的最佳工藝條件為萃取溫度58℃，萃取時(shí)間68min，萃取壓強(qiáng)為243bar；

3、在此條件下熊果酸含量為2.21mg/g，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)影響試驗(yàn)因素的主次排序：萃取壓力>萃取溫度>萃取時(shí)間。</p><p>　　關(guān)鍵詞：超臨界二氧化碳萃??；枇杷葉；熊果酸；高效液相色譜法</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In this paper, supercritica

4、l CO2 extraction of ursolic acid in loquat leaves were studied to investigate the extraction temperature, extraction time, extraction pressure of three factors on the results. By response surface method (RSM method) to o

5、ptimize the extraction of ursolic acid in loquat. High performance liquid chromatography Ursolic Acid Loquat Leaf Extract the content, using a central composite design to study the above three variables on the response f

6、rom the yield of ursolic acid. Th</p><p>　　Key Words: supercritical CO2 extraction;Follum eriobotryae;ursolic acid;HPLC</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1．前言1<

7、/b></p><p><b>　　2．材料與方法2</b></p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料2</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)原料2</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑2</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器2</p><p>　　2.

8、2 實(shí)驗(yàn)方法2</p><p>　　2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2</p><p>　　2.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2</p><p>　　2.2.3枇杷葉中熊果酸的提取并測(cè)定3</p><p>　　2.2.4色譜條件3</p><p><b>　　3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3</b></p>&

9、lt;p>　　3.1高效液相色譜法測(cè)定熊果酸的含量3</p><p>　　3.2單因素萃取實(shí)驗(yàn)3</p><p>　　3.2.1萃取溫度對(duì)熊果酸提取率的影響4</p><p>　　3.2.2萃取壓力對(duì)熊果酸提取率的影響4</p><p>　　3.2.3萃取時(shí)間對(duì)熊果酸提取率的影響5</p><p>　　

10、3.3多因素萃取實(shí)驗(yàn)5</p><p>　　3.3.1熊果酸提取參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果6</p><p>　　3.3.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析7</p><p>　　3.3.3因數(shù)間的交叉影響7</p><p>　　3.3.4熊果酸的HPLC結(jié)果10</p><p>　　3.3.5最佳條件確定11</p>

11、<p><b>　　4. 結(jié)論12</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)13</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica（Thunb.）Lindl.的葉。有清肺止咳，和胃降逆，止渴的功效[

12、1]。富含苦杏仁甙（amygdalin）、熊果酸、齊墩果酸、維生素B1、和C、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、糖類等化學(xué)成分。枇杷葉中的熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗?jié)?、降低血糖等多種生物學(xué)效應(yīng)，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能，因而被廣泛地用作醫(yī)藥和化妝品原料[2]。熊果酸臨床表現(xiàn)有顯著而迅速降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清轉(zhuǎn)氨酶、消退黃疽、增進(jìn)食欲、抗纖維化和恢復(fù)肝功能的作用，具有見(jiàn)效快、療程短、效果穩(wěn)定的特點(diǎn)。隨著當(dāng)前科學(xué)界對(duì)熊果酸的研究越來(lái)越深入細(xì)致

13、，越來(lái)越多的試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)顯示，熊果酸具有抗致癌、抗促癌、誘導(dǎo)F9畸胎瘤細(xì)胞分化和抗血管生成作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)：熊果酸能明顯抑制HL－60細(xì)胞增殖，可誘導(dǎo)其凋亡；能使小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著提高。體內(nèi)試驗(yàn)證明，熊果酸可以明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。說(shuō)明熊果酸的抗腫瘤作用廣泛，極有可能成為低毒有效的新型抗癌藥物。熊果酸對(duì)精子也有一定毒性作用，它能破壞膽間橋的肌動(dòng)蛋白，打開橋鍵，產(chǎn)生共質(zhì)體，抑制精子的形成, 利用這一作用有望開發(fā)成男性<

14、;/p><p>　　現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[7-9]的關(guān)于熊果酸的提取分離方法中,多采用乙醇提取、石油醚脫色、硅膠柱(或聚酰胺柱等) 分離、多次結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)室方法, 本研究以枇杷葉為原料，用超臨界萃取法探索其熊果酸的最優(yōu)提取條件，為枇杷葉的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。</p><p>　　最早將超臨界CO2萃取技術(shù)應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的是美國(guó)通用食品公司，之后法、英、德等國(guó)也很快將該技術(shù)應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)中[10]。

15、90年代初，中國(guó)開始了超臨界萃取技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化工作，發(fā)展速度很快。實(shí)現(xiàn)了超臨界流體萃取技術(shù)從理論研究、中小水平向大規(guī)模 產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)變，使中國(guó)在該領(lǐng)域的研究、應(yīng)用已同國(guó)際接軌，在某些方面達(dá)到了國(guó)際領(lǐng)先水平。目前，超臨界流體萃取已被廣泛應(yīng)用于從石油渣油中回收油品、從咖啡中提取咖啡因、從啤酒花中提取有效成分等工業(yè)中[11]。</p><p>　　超臨界流體萃取是利用溫度和壓力略超過(guò)或靠近臨界溫度和臨界壓力介于氣體和液體之

16、間的流體作為萃取劑，從固體或液體中萃取某種高沸點(diǎn)和熱敏性成分，以達(dá)到分離和提純的目的[12]。目前常用的萃取劑為二氧化碳。此法可避免使用有毒溶劑，溶劑回收簡(jiǎn)便，可在較低溫度下操作，防止多酚高溫氧化，保證產(chǎn)品質(zhì)量。具有夾帶劑用量少，萃取時(shí)間短，萃取效率高的優(yōu)點(diǎn)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料&

17、lt;/b></p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)原料</p><p>　　枇杷葉10月購(gòu)于藥房。</p><p>　　枇杷葉的前處理：購(gòu)買的枇杷葉為10g一小包的粉末狀，將它放在干燥處保存</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑</p><p>　　本研究使用的主要化學(xué)藥品和試劑如下（見(jiàn)表1）：</p&

18、gt;<p>　　表1 主要化學(xué)藥品和試劑</p><p>　　Table 1 Main chemical and reagents</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器</p><p>　　主要儀器和設(shè)備如下（見(jiàn)表2）：</p><p>　　表2 主要儀器和設(shè)備</p><p>　　Table

19、 2 The main instruments and equipment</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制</p><p>　　精密稱取熊果酸對(duì)照品200.0mg置于100mL容量瓶中，以甲醇定容，得到2.0mg/mL的對(duì)照品溶液。再依次稀釋制備得1.5，1.0，0.5，0

20、.25mg/mL熊果酸對(duì)照品溶液。分別精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。其峰面積和濃度呈線性相關(guān)。</p><p>　　2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)</p><p>　　2.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)</p><p>　　超臨界CO2萃取熊果酸選取萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間三個(gè)因素。溫度分別為40℃、50℃、60℃

21、、70℃、80℃，壓力為150 bar、200 bar、250bar、300bar、350bar，時(shí)間為30min、55min、80min、105min、130min。</p><p>　　2.2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)</p><p>　　先對(duì)萃取溫度（X1）萃取壓力(X2)和萃取時(shí)間(X3)進(jìn)行編碼，熊果酸超臨界提取響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。</p>&l

22、t;p>　　2.2.3 枇杷葉中熊果酸的提取并測(cè)定</p><p>　　準(zhǔn)確稱取2.0g枇杷葉與試紙上，用超臨界CO2萃取裝置按既定的萃取溫度、萃取壓強(qiáng)、萃取時(shí)間三個(gè)因素萃取熊果酸，再用95%的乙醇溶液定容至10mL，溶解，取上清液用高效液相色譜法測(cè)定提取物中的熊果酸含量。</p><p>　　2.2.4 色譜條件</p><p>　　ODS柱(4.6 mm

23、×250 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(90：10：0.06)，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，流速為0.6 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μL。</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p>　　3.1 高效液相色譜法測(cè)定熊果酸的含量</p><p>　　圖1 熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線</p>

24、<p>　　Figure1 The standard curve of ursolic acid</p><p>　　該曲線的回歸方程為y=3246.7x-22.493，相關(guān)系數(shù)R=0.9956。</p><p>　　3.2 單因素萃取實(shí)驗(yàn)</p><p>　　3.2.1 萃取溫度對(duì)熊果酸提取率的影響 </p><p>　　圖2 溫

25、度對(duì)熊果酸提取量的影響</p><p>　　Figure2 the amount of temperature on the extraction of ursolic acid</p><p>　　圖2萃取壓力為250bar，萃取時(shí)間為45min，萃取溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。橫坐標(biāo)為萃取溫度，縱坐標(biāo)為熊果酸提取量。</p><p>　　從

26、圖得知60 ℃為最佳萃取溫度。表明溫度影響超臨界萃取的二重性： 一方面溫度升高， 溶質(zhì)揮發(fā)度增大，在CO2 中的溶解度增大；另一方面溫度升高，CO2 密度下降，溶劑的溶解能力下降。</p><p>　　3.2.2 萃取壓力對(duì)熊果酸提取率的影響 </p><p>　　圖3 壓力對(duì)熊果酸提取量的影響</p><p>　　Figure3 the amount of pre

27、ssure on the extraction of ursolic acid</p><p>　　圖3溫度控制在60℃，萃取時(shí)間為45min，萃取壓力分別為150bar、200bar、250bar、300bar、350bar。橫坐標(biāo)為萃取壓力，縱坐標(biāo)為熊果酸提取量。</p><p>　　結(jié)果表明：在150-250bar，壓力升高，CO2 密度增加，熊果酸收率增加極為明顯，超過(guò)250bar

28、 后，熊果酸收率隨壓力升高而下降，所以最佳壓力選為250bar。</p><p>　　3.2.3 萃取時(shí)間對(duì)熊果酸提取率的影響</p><p>　　圖4 萃取時(shí)間對(duì)熊果酸提取量的影響</p><p>　　Figure4 the extraction time on extraction yield of ursolic acid</p><p&g

29、t;　　圖4溫度控制在60℃，萃取壓力為250bar，萃取時(shí)間分別為30min、55min、80min、105min、130min。橫坐標(biāo)為萃取時(shí)間，縱坐標(biāo)為熊果酸提取量。</p><p>　　從圖可知隨著時(shí)間的增加熊果酸的提取量在逐漸增加，之后變得緩慢，波動(dòng)幅度非常小。故68min為最佳萃取時(shí)間。</p><p>　　3.3 多因素萃取實(shí)驗(yàn)</p><p>　　通

30、過(guò)以上的單因素實(shí)驗(yàn)，選取萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間三個(gè)相對(duì)影響較大的因素作多因素實(shí)驗(yàn)。多因素試驗(yàn)表設(shè)計(jì)如下：</p><p><b>　　表3 因素水平表</b></p><p>　　Table 3 Factors and levels</p><p><b>　　表4 試驗(yàn)結(jié)果表</b></p>&

31、lt;p>　　Table 4 The result of test</p><p>　　熊果酸提取參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果</p><p>　　表5 參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果表</p><p>　　Table 5 parameter mathematical regression analysis table</p><p>　　3.3.

32、2 實(shí)驗(yàn)資料分析</p><p>　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SAS8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到以熊果酸提取量為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于各條件編碼值的二次回歸方程為：

33、

34、 </p><p>　　Y = 0.199667 + 0.01525X1 + 0.029X2 + 0.012X3 - 0.032958X12 + 0.00825X1X2 - 0.00925X1X3 - 0.104958X22 - 0.00375X2X3 + 0.012042X32 </p><p>　　式中萃取溫度，萃取壓力，萃取時(shí)間在分析中均經(jīng)

35、過(guò)線性編碼處理，分別對(duì)應(yīng)X1，X2，X3。因此，方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各提取因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。從二次方程中可以簡(jiǎn)單看出萃取壓力對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大。</p><p>　　3.3.3 因子間的交叉影響</p><p>　　各因子交叉作用對(duì)熊果酸提取量的影響（X1為萃取溫度，X2為萃取壓力，X3為萃取時(shí)間，Y1為熊果酸提取率mg/g）如圖。.<

36、;/p><p>　　圖5 萃取溫度與萃取壓力對(duì)熊果酸提取量的影響</p><p>　　Figure5 the extraction temperature and extraction pressure on extraction yield of ursolic acid</p><p>　　從圖中我們可以直觀的看出溫度，壓力，時(shí)間對(duì)熊果酸的提取的影響。其中壓力，

37、溫度影響最為明顯，而從圖7，9中看出時(shí)間對(duì)熊果酸的提取影響相對(duì)較小，響應(yīng)值沒(méi)有很明顯變化。從表5還可以看出，X2 (壓力)的F值最大，F(xiàn)數(shù)值較大時(shí)表明該因素采取不同的水平對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，與直觀分析的結(jié)果一致。所以對(duì)影響試驗(yàn)因素的主次排序：萃取壓力>萃取溫度>萃取時(shí)間。</p><p>　　圖6 響應(yīng)面法（X1.X2）立體分析圖和相應(yīng)等高線圖</p><p>　　Figur

38、e 6 Response surface method (X1.X2) analysis diagram and the corresponding three-dimensional contour map</p><p>　　圖7 萃取壓力與萃取時(shí)間對(duì)熊果酸提取量的影響</p><p>　　Figure 7 extraction pressure and extraction t

39、ime on extraction yield of ursolic acid</p><p>　　圖8 響應(yīng)面法（X2.X3）立體分析圖和相應(yīng)等高線圖</p><p>　　Figure 8 Response Surface Methodology (X2.X3) analysis diagram and the corresponding three-dimensional cont

40、our map</p><p>　　圖9 萃取溫度與萃取時(shí)間對(duì)熊果酸提取量的影響</p><p>　　Figure 9 extraction temperature and extraction time on extraction yield of ursolic acid</p><p>　　圖10 響應(yīng)面法（X1.X3）立體分析圖和相應(yīng)等高線圖</

41、p><p>　　Figure 10 Response Surface Method (X1.X3) analysis diagram and the corresponding three-dimensional contour map</p><p>　　3.3.4 熊果酸的HPLC結(jié)果</p><p>　　如圖，圖11是標(biāo)準(zhǔn)熊果酸樣品的HPLC圖，圖12是用超臨界

42、萃取的熊果酸的HPLC圖，用超臨界萃取的熊果酸的保留時(shí)間為12.8min，標(biāo)樣的保留時(shí)間時(shí)間為12.8min，由此可以定性說(shuō)明這兩個(gè)峰的物質(zhì)是同一種物質(zhì)。 </p><p>　　從圖12可見(jiàn)，通過(guò)超臨界萃取的熊果酸的純度較高，含量達(dá)90%，保留時(shí)間10min之前的峰比較復(fù)雜，保留時(shí)間在3.0min附近的峰圖11和圖12中峰面積基本不變，判斷為溶劑峰，圖12中保留時(shí)間為6.7min的組分為雜質(zhì)，由此可看出，超

43、臨界CO2 萃取枇杷葉熊果酸的效果好，萃取物中的熊果酸含量高。</p><p>　　圖11 熊果酸標(biāo)樣HPLC 圖</p><p>　　Fig 11 HPLC spectrum of ursolic acid</p><p>　　圖12 超臨界萃取產(chǎn)物的高效液相色譜圖</p><p>　　Fig 12 HPLC spectrum of

44、 ursolic acid from Follum eriobotryae</p><p>　　with ethanol by SFE</p><p>　　3.3.5 最佳條件確定</p><p>　　回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的均方差和系數(shù)都較大，而交互項(xiàng)系數(shù)較小，說(shuō)明響應(yīng)面分析所選這三個(gè)因素的交互效應(yīng)較小。對(duì)全變量的二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，考察所擬合的相應(yīng)曲面形

45、狀。關(guān)鍵因素與響應(yīng)值之間的相互作用可通過(guò)圖5~圖10的響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖反映出來(lái)。從圖中可以看出，三個(gè)關(guān)鍵因素在所確定的濃度范圍內(nèi)對(duì)熊果酸的提取率的影響都是顯著的，但各因素間存在的交互作用仍然存在一定的差別。為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳的值，將所得回歸方程分別對(duì)各自變量取一階偏導(dǎo)等于零可得一個(gè)三元一次方程組：</p><p>　　0=0.01525-0.065916X1+0.00825X2-0.00925X3<

46、/p><p>　　0=0.029+0.00825X1-0.209916X2- 0.00375X3</p><p>　　0=0.012-0.00925X1- 0.00375X2+0.024084X3</p><p>　　推出X1=0.158</p><p><b>　　X2=0.158</b></p><p

47、><b>　　X3=1 </b></p><p>　　條件范圍內(nèi)取萃取溫度為58℃，萃取壓強(qiáng)為243bar，萃取時(shí)間為68min。在這狀態(tài)下所萃取的熊果酸含量最高，為2.254mg/g。</p><p>　　取理論值條件，即萃取溫度為58℃，萃取壓強(qiáng)為243bar，萃取時(shí)間為68min，進(jìn)行3次提取實(shí)驗(yàn)取平均值，得到的熊果酸平均提取率為2.21mg/g。<

48、/p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　本文通過(guò)超臨界CO2萃取法萃取枇杷葉中的熊果酸，用95%乙醇定容，得到較純的熊果酸，最后用高效液相色譜法測(cè)定熊果酸的的含量，得出以下結(jié)論：</p><p>　　1. 確定了高效液相色譜法測(cè)定熊果酸的具體條件及進(jìn)樣量。色譜柱為ODS柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)，流

49、動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(90∶10∶0.06)，檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，流速為0.6 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μL。熊果酸保留時(shí)間12.8min，確定了濃度與峰面積的線性方程y=3246.7x-22.493，相關(guān)系數(shù)R=0.9956。</p><p>　　2. 超臨界二氧化碳流體萃取枇杷葉熊果酸各因素影響程度(由大至小)為：萃取壓力，萃取溫度，萃取時(shí)間。最佳條件為：萃取溫度為58℃，萃取壓力為243

50、bar，萃取時(shí)間為68min。在最佳組合條件下進(jìn)行萃取，熊果酸含量最大，為2.254mg/g。</p><p>　　取理論值條件，即萃取溫度為58℃，萃取壓強(qiáng)為243bar，萃取時(shí)間為68min，進(jìn)行3次提取實(shí)驗(yàn)取平均值，得到的熊果酸平均提取率為2.21mg/g。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 蔣盛巖

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