豬MHCⅡ類反式激活因子CIITA基因2個突變體的鑒定及其多克隆抗體的制備.pdf

1、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是黃病毒科瘟病毒屬的一個成員，所引起的豬瘟是一種高度傳染性和致死性的疾病。近年的研究表明，豬瘟病毒在免疫豬的扁桃體、淋巴結和睪丸等多個器官持續(xù)性感染，豬瘟病毒在宿主體內的持續(xù)性感染是該病反復發(fā)作難以根絕的主要原因。
　　 MHCⅡ類反式激活因子(Major Histocompatibility ClassⅡTransactivator，CIITA)，是一

2、個重要的共激活因子，其主要作用是通過蛋白的羧基端與結合到MHCⅡ類基因啟動子上的多個轉錄因子相互作用，成為這些轉錄因子的支架，共同發(fā)揮對MHCⅡ類分子表達的調控作用。
　　 本實驗室之前的研究結果表明，在豬瘟病毒感染的豬外周血淋巴細胞和體外培養(yǎng)的PK-15細胞中，主要組織相容性復合體Ⅱ(MaiorHistocompatibility ClassⅡ，MHCⅡ)的表達水平均出現明顯下調。CIITA是調節(jié)MHCⅡ表達的關鍵性分子，本研

3、究的目的在于克隆豬CIITA基因，制備抗CⅡTA蛋白的多克隆抗體，使用制備的多克隆抗體檢測真核轉染的CⅡTA蛋白在PK-15細胞中的表達，探索CIITA蛋白的表達以及隨后的MHCⅡ的表達與豬瘟病毒感染的關系，為進一步探索豬瘟病毒持續(xù)性感染的機制打下基礎。
　　 本實驗通過分離成年長白豬外周血淋巴細胞并抽提總RNA，RT-PCR擴增豬的CⅡTA基因，對擴增得到的豬CⅡTA基因的測序分析表明，我們獲得了3條豬CIITA基因的序列，分

4、別命名為CⅡTA4、CⅡTA8和CⅡTA-N，其中，CⅡTA4基因與參考基因(登錄號為AY084053.1)的核苷酸序列的同源性達到99.4％，氨基酸同源性為98.6％；序列比對時我們還發(fā)現，CIITA8基因的核苷酸序列在其ORF的929.968位出現了40 bp的堿基丟失的情況，CIITA-N基因的核苷酸序列在其ORF的225.368位和926-968位分別出現了144 bp和40 bp的堿基丟失；對CIITA8和CIITA-N進行氨

5、基酸推導分析發(fā)現，因為926-968位基因片段的丟失，使得這兩個基因的終止密碼TGA提前，CIITA8和CⅡTA-N編碼的蛋白質序列被縮短。所以本實驗所獲得的3條基因序列CⅡTA4、CⅡTA8和CⅡTA-N編碼的蛋白質長度分別為565 aa、312 aa和264 aa，初步推測這種核苷酸片段的丟失可能與CⅡTA基因的前體mRNA的選擇性剪切有關。
　　 本研究擴增包含CⅡTA4基因3’端的723 bp的核苷酸片段并將其亞克隆到原

6、核表達載體PET-32a+上，成功構建PET-CⅡTA4-C原核表達載體并將其轉化到大腸桿菌BL-21中進行IPTG的誘導表達。鑒定重組蛋白CⅡTA4-C的表達形式后，用Ni-NTA親和層析的方法純化重組蛋白并對其進行復性，復性后的重組蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體并對制備的抗體進行反應性和效價的檢測。同時，我們還構建了包含CⅡTA4基因ORF的真核表達載體PCDNA3.0-GFP-CⅡTA4，并成功在PK-15細胞上表達。