轉(zhuǎn)高效表達(dá)HMW-Glu（5+10）基因小麥的研究.pdf

1、小麥面包烘烤品質(zhì)的改良是小麥品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。小麥高分子量麥谷蛋白5亞基和10亞基的存在與否及其含量的高低，對(duì)小麥面包烘烤品質(zhì)的改良至關(guān)重要。為了獲得高效表達(dá)高分子量麥谷蛋白5亞基和10亞基的小麥新品種(系)，本試驗(yàn)以河南省曾經(jīng)大面積推廣的品種豫麥18的幼胚愈傷組織為受體，利用基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了小麥高分子量麥谷蛋白5亞基和10亞基基因的高效表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化工作，并對(duì)影響轉(zhuǎn)化效果的一些因素進(jìn)行了探討。主要研究結(jié)果如下

2、： 為了提高目的基因的表達(dá)水平、克服基因沉默，我們構(gòu)建了高效表達(dá)載體。主要是在目的基因的后邊加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)(KDEL)基因，在載體上加上小麥MAR(matrixattachmentregions)，構(gòu)建成含有高分子量麥谷蛋白5亞基和10亞基基因的高效表達(dá)載體(p1301-Mar+Sub5+KDEL+Sub10+KDEL)。經(jīng)酶切鑒定，證明高效表達(dá)載體構(gòu)建成功。 利用基因槍法轟擊豫麥18幼胚愈傷組織共9565塊，共得到

3、169株再生植株，經(jīng)PCR鑒定初步表明，出現(xiàn)5亞基基因預(yù)期大小DNA片段的植株有137株，PCR陽性率為81.1％；出現(xiàn)10亞基基因預(yù)期大小DNA片段的植株有142株，PCR陽性率為84％；其中同時(shí)擴(kuò)增出5亞基和10亞基片段的有116株，PCR陽性率為68.6％。大部分植株能夠開花結(jié)實(shí)，少數(shù)植株出現(xiàn)不育現(xiàn)象。 對(duì)基因槍法轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織的幾個(gè)技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，在預(yù)培養(yǎng)3d的愈傷組織作為受體優(yōu)于預(yù)培養(yǎng)10d的愈傷組

4、織，金粉用量為250μg·槍-1、靶距為12cm時(shí)轉(zhuǎn)化效果較好，轟擊后使用濃度為20mg·L-1的潮霉素進(jìn)行篩選即可達(dá)到抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的效果。 以含有HMW-Glu(5+10)基因的農(nóng)桿菌(EHA105)對(duì)源于豫麥18幼胚的愈傷組織進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化幼胚愈傷組織共751塊，得到6株再生植株，經(jīng)PCR初步檢測(cè)表明，有2株的基因組中5亞基基因呈現(xiàn)陽性，其中1株的基因組5亞基和10亞基基因均呈現(xiàn)陽性。 對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺

5、傳轉(zhuǎn)化的幾個(gè)重要因素進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)乙酰丁香酮濃度為200μmol·L-1、菌液濃度(OD600)為0.5、侵染時(shí)間為1h、侵染后對(duì)愈傷組織適當(dāng)干燥處理可有效提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已獲得的轉(zhuǎn)基因植株的T1、T2代種子的胚乳蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明，小麥轉(zhuǎn)基因后代種子胚乳中外源基因表達(dá)非常復(fù)雜，與對(duì)照相比出現(xiàn)以下幾種情況：a)無蛋白帶差異；b)T1有1條蛋白帶差異；c)T1有2條蛋白帶差異，且與預(yù)期位置