耶爾森強(qiáng)毒力島(HPI)在禽大腸桿菌中水平轉(zhuǎn)移及功能評(píng)價(jià).pdf

1、耶爾森強(qiáng)毒力島(HPI)是發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌屬染色體上的成簇基因區(qū)域,具有典型的毒力島特征,主要包含與鐵攝取有關(guān)的毒力基因簇,即耶爾森桿菌素(yersiniabactin,Ybt,鐵載體)基因及其調(diào)控基因,行使對(duì)鐵的攝取功能。HPI的結(jié)構(gòu)特征及其在腸道桿菌中的廣泛分布提示其可能存在水平轉(zhuǎn)移,而有關(guān)禽大腸桿菌HPI在低溫低鐵共培養(yǎng)條件下的水平轉(zhuǎn)移尚未見報(bào)道。有研究表明,大腸桿菌中HPI主要具有鐵攝取與調(diào)節(jié)功能,可賦予細(xì)菌毒力和致病性,但對(duì)于宿

2、主菌獲得HPI后的功能變化仍未見報(bào)道。
　　為探討HPI在禽大腸桿菌中的分布、轉(zhuǎn)移特點(diǎn)及其在受體菌中的功能,本研究對(duì)禽大腸桿菌臨床分離中HPI的分布情況進(jìn)行分析;選擇合適的分離株作為HPI轉(zhuǎn)移的供、受體,低溫低鐵條件下共培養(yǎng)后篩選轉(zhuǎn)移陽性株;對(duì)比HPI轉(zhuǎn)移前后受體菌的生物學(xué)活性變化,初步研究HPI在禽大腸桿菌中轉(zhuǎn)移特性和功能,為進(jìn)一步明確HPI在大腸桿菌中的分布特性及其與禽大腸桿菌致病性的關(guān)系提供一些基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:

3、
　　1、禽大腸桿菌臨床分離株中HPI的分布及HPI+株相關(guān)性分析
　　以臨床分離的禽大腸桿菌的基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)并合成irp2、fyuA、intB和ERIC基因的特異性引物,應(yīng)用所建立的PCR方法檢測(cè)臨床分離株中HPI的攜帶情況及各HPI陽性株間基因型相關(guān)性,同時(shí)對(duì)比分析各HPI陽性株中所攜帶irp2和intB基因的相關(guān)性,結(jié)果40株禽大腸桿菌分離株中有7檢出HPI,陽性率為17.5％,有一株陽性株存在fyuA缺失;

4、對(duì)HPI陽性株基因型相關(guān)性分析結(jié)果顯示,7株大腸桿菌的基因型之間存在較大的差異,說明HPI可存在于多個(gè)基因型的大腸桿菌中;對(duì)HPI陽性株irp2和intB基因相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),irp2和intB基因總體表現(xiàn)出較高保守性的特點(diǎn),兩個(gè)基因均存在菌種間的同源性高于種內(nèi)的情況。
　　2、禽大腸桿菌中HPI的轉(zhuǎn)移及其供、受體菌的研究
　　選擇合適供、受體株,活化后按10%的比例接種于含有0.2mM的LB液體培養(yǎng)基中,4℃培養(yǎng);依次用氯霉

5、素抗性平板、irp2基因PCR和ERIC-PCR方法檢測(cè),篩選HPI轉(zhuǎn)移株;對(duì)比分析轉(zhuǎn)移株與受體株基因型的差異,確定HPI轉(zhuǎn)移的受體株;PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)移株與供體株的intB基因,確定HPI轉(zhuǎn)移的供體菌。結(jié)果,從氯霉素抗性平板上檢測(cè)到HPI陽性菌落,ERIC-PCR對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn),該菌與受體株AE-a1基因型相似性為100%,與其它菌株差異均在20%以上;Int基因檢測(cè)對(duì)比發(fā)現(xiàn),該基因在AE-t和AE-d2中的大小相同,不同于AE-d1。<

6、br>　　3、HPI的轉(zhuǎn)移對(duì)受體菌生長(zhǎng)特性和致病性影響的研究
　　分別從以下方面檢測(cè)HPI的轉(zhuǎn)移對(duì)受體菌功能的影響:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入LB液體培養(yǎng)基,接入受試菌培養(yǎng),每隔2小時(shí)測(cè)菌液OD600并繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線,比較轉(zhuǎn)移陽性株和受體株生長(zhǎng)曲線的差異;取菌懸液接種于CAS固體平板上,培養(yǎng)到菌落直徑不再發(fā)生變化,通過CAS平板上的暈圈半徑初步檢測(cè)菌株產(chǎn)鐵載體的能力;在LB培養(yǎng)基中加入不同劑量螯合劑,接入等量的菌液,進(jìn)行鐵脅迫實(shí)驗(yàn)

7、,比較兩株菌的低鐵耐受能力;通過檢測(cè)受體株和轉(zhuǎn)移株對(duì)DF-1細(xì)胞的侵襲粘附力及其對(duì)7日齡雛雞的致死能力,比較兩株菌的毒力差異。生長(zhǎng)曲線檢測(cè)結(jié)果顯示,AE-a1的生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于AE-t;CAS檢測(cè)結(jié)果顯示,AE-t產(chǎn)鐵載體的能力最強(qiáng),高于AE-a1,也高于AE-d1;不含有鐵螯合劑的培養(yǎng)基中,AE-a1的生長(zhǎng)狀況要好于AE-t;在鐵鰲合劑濃度大于等于0.128mM的培養(yǎng)基中,AE-t的生長(zhǎng)速度均高于AE-a1,且在前24h差異顯著;細(xì)胞