桑葉中酪氨酸酶抑制成分的研究.pdf

1、我國(guó)具有豐富的桑葉資源；但傳統(tǒng)的桑葉只用于養(yǎng)蠶，用途單一，出現(xiàn)了大量桑葉過(guò)?，F(xiàn)象。酪氨酸酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)黑色素形成的關(guān)鍵酶；其抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域用于治療和預(yù)防黑色素瘤、黃褐斑等色素沉著性疾病，在化妝品領(lǐng)域用于人體肌膚的美白，在食品工業(yè)領(lǐng)域用于預(yù)防果蔬因褐變而失鮮變質(zhì)，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域因酪氨酸酶是昆蟲(chóng)賴(lài)以生存的關(guān)鍵酶而成為最有前景的生物殺蟲(chóng)藥劑之一，因而酪氨酸酶抑制劑的開(kāi)發(fā)有著廣闊的應(yīng)用前景。 傳統(tǒng)的酪氨酸酶抑制劑大多

2、是化學(xué)合成，毒副作用明顯。近年來(lái)，安全而有效的天然植物成為該類(lèi)產(chǎn)品的發(fā)展方向；但有關(guān)桑葉中酪氨酸酶的抑制成分的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以浙江湖州產(chǎn)桑葉為試驗(yàn)材料，對(duì)桑葉中對(duì)酪氨酸酶活力具有抑制作用的成分進(jìn)行了篩選，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了研究：同時(shí)，評(píng)價(jià)了其抗氧化能力和抑菌活性，并對(duì)相關(guān)活性成分的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期實(shí)現(xiàn)桑葉的最大化利用。主要研究結(jié)果如下： 1、在不同季節(jié)桑葉中，以秋季桑葉的醇提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用最強(qiáng)。以對(duì)酪氨

3、酸酶的抑制率為指導(dǎo)，對(duì)秋季桑葉的醇提物依次用不同極性溶劑萃取、聚酰胺柱層析、硅膠柱層析、醇-水重結(jié)晶逐級(jí)分離，得到對(duì)酪氨酸酶活力具有顯著抑制作用的成分，產(chǎn)率為0.025mg/g；其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆抑制。經(jīng)過(guò)初步鑒定，該物質(zhì)中含有黃酮類(lèi)化合物。 2、對(duì)桑葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。超聲波輔助提取、超高壓提取和微波輔助提取可提高桑葉黃酮類(lèi)化合物提取效果，其中超聲波輔助提取法效果最好。確定優(yōu)化條件為70％乙醇提取溶

4、劑、1:20料液比、200 W功率超聲預(yù)處理10 min、700℃提1.5 h；桑葉黃酮提取得率為28.8 mg/g。經(jīng)分離、結(jié)構(gòu)鑒定，得到5種黃酮單體：蘆丁(Rutin)、異槲皮甙(Isoquercitrin)、紫云英甙(Astragalin)、桑色素(Morin)和山奈酚(Kaempferol)。 3、對(duì)所提取得到的黃酮類(lèi)化合物對(duì)酪氨酸酶活力的影響進(jìn)行了研究。桑葉黃酮類(lèi)化合物表現(xiàn)出對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的抑制率(IC50=20

5、0 μg/mL)高于對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性的抑制率(IC50=300 μg/mL)；且桑葉總黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用顯著高于各黃酮單體對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，說(shuō)明桑葉黃酮類(lèi)化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用存在各單體間的協(xié)同配伍作用。 4、桑葉黃酮單體蘆丁、異槲皮甙、紫云英甙、桑色素和山奈酚的混合物對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理研究表明，桑葉黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制效應(yīng)屬于可逆過(guò)程，說(shuō)明桑葉黃酮和酶的結(jié)合導(dǎo)致酶活力受抑制，但并不導(dǎo)致酶的分子構(gòu)象永久變化而

6、失活。由桑葉黃酮的結(jié)構(gòu)可推測(cè)，桑葉黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用與其分子中大量的還原性羥基與酪氨酸酶分子中Cu2+的絡(luò)合有關(guān)，且其結(jié)構(gòu)與酪氨酸酶底物的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，均為對(duì)位苯酚的結(jié)構(gòu)，可與酪氨酸酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而削弱了酪氨酸酶對(duì)酪氨酸及其系列氧化產(chǎn)物的催化氧化作用。桑葉黃酮對(duì)酪氨酸酶的單酚酶活性的抑制表現(xiàn)為既降低了其穩(wěn)態(tài)酶活力，又延長(zhǎng)了其遲滯時(shí)間：對(duì)酪氨酸酶的二酚酶活力表現(xiàn)為混合型抑制作用，說(shuō)明桑葉黃酮可以和游離酶及酶.底物絡(luò)合物結(jié)合；對(duì)游離酶的

7、抑制常數(shù)(KI)和對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)(KIS)分別為176.01 μg/mL和1259.20 μg/mL；KI