文昌魚(yú)VEGF與VEGFR的時(shí)空表達(dá)與功能初探.pdf

1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF及其受體VEGFR是血管生成的重要促進(jìn)因子，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、促進(jìn)血管形成、增強(qiáng)血管通透性。通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，發(fā)現(xiàn)單拷貝的VEGF和VEGFR。本文克隆了文昌魚(yú)VEGF和VEGFR，對(duì)其序列進(jìn)行分析，并進(jìn)一步研究其表達(dá)與功能。
　　 文昌魚(yú)VEGF的最大開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1047bp，編碼由348個(gè)氨基酸組成的蛋白，含有PDGF結(jié)構(gòu)域，推測(cè)蛋白分子量為39kDa。序列比對(duì)分析表明，文昌

2、魚(yú)VEGF與脊椎動(dòng)物的序列同源性較低，約為30％-34％，在PDGF結(jié)構(gòu)域處稍高為46%-48%。其中與VEGF-C和VEGF-D的相似性比與VEGF-A和VEGF-B高。內(nèi)含子外顯子時(shí)相分析顯示，文昌魚(yú)VEGF也與VEGF-C和VEGF-D相近，其第5號(hào)外顯子對(duì)應(yīng)VEGF-C和VEGF-D的第5、6號(hào)外顯子，各外顯子大小相近，且內(nèi)含子類型相同。共線性分析表明，除了VEGF-A，脊椎動(dòng)物VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D基因座位和

3、文昌魚(yú)VEGF的相似。更進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，文昌魚(yú)VEGF與VEGF-C和VEGF-D聚為一類，并位于其分支的基部。上述分析表明文昌魚(yú)VEGF很可能具有脊椎動(dòng)物VEGF-C和VEGF-D分子的特性。
　　 文昌魚(yú)VEGFR已克隆一段4075bp長(zhǎng)的片段，在基因組中僅存在單一拷貝，其中ORF長(zhǎng)3873 bp(還缺少3’末端39個(gè)堿基)，編碼蛋白含有1290個(gè)氨基酸，含有膜外的七個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和膜內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)

4、構(gòu)域，推測(cè)蛋白分子量為143kDa左右。文昌魚(yú)VEGFR與脊椎動(dòng)物VEGFR序列同源性約在33％-35％之間，其中在IG結(jié)構(gòu)域的序列同源性僅為27％-29％，而在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域處為59％-61％，暗示胞外區(qū)受到較大的選擇壓力。內(nèi)含子外顯子類型分析表明，從文昌魚(yú)VEGF到脊椎動(dòng)物VEGFRs進(jìn)化過(guò)程中外顯子發(fā)生合并和分化，但內(nèi)含子類型不變。共線性分析顯示，在VEGFR1-4上都存在有文昌魚(yú)VEGFR的臨位基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，文昌魚(yú)V

5、EGFR出現(xiàn)于基因復(fù)制之前，位于脊椎動(dòng)物VEGFRs分支的基部，暗示VEGFR的功能可能比較原始。
　　 我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和原位雜交實(shí)驗(yàn)確定文昌魚(yú)VEGF和VEGFR的表達(dá)圖示。實(shí)時(shí)定量PCR顯示，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，VEGF和VEGFR在胚胎發(fā)育早期2-8細(xì)胞時(shí)就有表達(dá)，且隨發(fā)育時(shí)間表達(dá)量上升，囊胚期表達(dá)量最高，進(jìn)入神經(jīng)胚之后逐漸降低。在成體中總的表達(dá)量很低，但仍集中表達(dá)于鰓、肝盲囊、消化道中。整體原位雜交結(jié)果顯示VE

6、GF和VEGFR在原腸胚之前的信號(hào)較強(qiáng)，囊胚和原腸胚期二者信號(hào)在整個(gè)胚胎皆有表達(dá)；神經(jīng)胚期信號(hào)減弱，存在于內(nèi)胚層和中胚層；幼魚(yú)中的信號(hào)微弱，出現(xiàn)在消化道和鰓；切片原位雜交顯示，二者信號(hào)在成體中集中于鰓、肝盲囊和卵巢中，腸中亦有表達(dá)。結(jié)合實(shí)時(shí)定量和原位雜交的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)VEGF和VEGFR在胚胎以及成體中的表達(dá)模式基本一致，暗示二者存在潛在的相互作用，此點(diǎn)仍需蛋白水平的定位和互作實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
　　 用細(xì)菌感染成魚(yú)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量P