牛羊豬犬種布魯氏菌多重PCR方法的建立及試劑盒研制.pdf

1、布魯氏菌?。╞rucellosis，簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鸬囊环N人獸共患病。該病廣泛分布于世界各地，有170多個國家存在人畜布病。2000年以后，我國人畜布病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來了巨大的危害。
　　布魯氏菌屬中的牛、羊、豬、犬種布魯氏菌不但可以感染家畜，而且均可以感染人類，是危害最為嚴(yán)重的種型。我國人畜布病中多種型感染的現(xiàn)象較為常見。牧區(qū)牛羊的養(yǎng)殖量大，人畜布病的疫情尤為嚴(yán)重。豬布病引起的感染現(xiàn)

2、象不如牛羊布病疫情嚴(yán)重，不過豬布病引起人感染的報道也不少。我國犬的飼養(yǎng)量巨大，犬感染布魯氏菌已得到證實(shí)。由于犬與人的接觸密切，犬布病對人類構(gòu)成了潛在威脅。目前，我國現(xiàn)有的布病病原學(xué)診斷方法均不能有效地區(qū)別牛、羊、豬、犬種布魯氏菌。因此，研究一種能同時檢測牛、羊、豬、犬種布魯氏菌的多重PCR方法并組裝出試劑盒，對于布病的流行病學(xué)調(diào)查和防控均具有重要的意義。
　　本研究首先對牛、羊、豬、犬種布魯氏菌的基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，根據(jù)

3、牛、羊種布魯氏菌在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白（BR0951-BR0955）上缺失2653個堿基，犬種布魯氏菌在wbkF-wbkD區(qū)域缺失351個堿基，以及牛、羊種布魯氏菌IS711拷貝數(shù)和位置的差異，設(shè)計了四對引物，根據(jù)PCR擴(kuò)增目的片段的大小，鑒別牛、羊、豬、犬種布魯氏菌的種型。對退火溫度、延伸時間、引物濃度等PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳的多重PCR反應(yīng)，并對優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)進(jìn)行特異性、靈敏度、重復(fù)性分析。最后，通過制備牛羊豬犬種

4、布魯氏菌的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、PCR引物、PCR反應(yīng)液等組分，組裝了牛羊豬犬種布魯氏菌多重PCR檢測試劑盒，從特異性、靈敏度、重復(fù)性、保存期等方面對試劑盒的性能進(jìn)行了評價。初步應(yīng)用該試劑盒檢測模擬的奶樣、小鼠的脾臟、牦牛和羊流產(chǎn)胎兒脾臟菌液樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證試劑盒對樣本檢測的實(shí)用性。
　　本研究利用單對引物PCR反應(yīng)初步驗(yàn)證所設(shè)計的4對引物是正確的，可以用于多重PCR反應(yīng)。通過對引物濃度、退火溫度、退火時間、延伸時間、循環(huán)參數(shù)的

5、優(yōu)化，建立了最佳的多重PCR反應(yīng)，并從特異性、靈敏度、重復(fù)性三方面對多重PCR方法進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，該方法的特異性強(qiáng)，與小腸耶爾森氏菌O∶9、大腸桿菌O157∶H7等與布魯氏菌親緣關(guān)系較近的細(xì)菌反應(yīng)皆為陰性;靈敏度高，檢測牛、羊、豬、犬種布魯氏菌的靈敏度分別為1.1×102CFU/mL、5.1×102CFU/mL、2.5×102CFU/mL、3.5×102CFU/mL，靈敏度都達(dá)到102CFU/mL以上。重復(fù)驗(yàn)證多重PCR反應(yīng)，結(jié)果

6、一致，表明該多重PCR方法的重復(fù)性好。
　　根據(jù)建立的多重PCR檢測方法，制備了陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，PCR引物、PCR反應(yīng)液等組分，組裝了牛羊豬犬種布魯氏菌多重PCR檢測試劑盒。試劑盒的特異性強(qiáng)，與小腸耶爾森氏菌O∶9、大腸桿菌O157∶H7等與布魯氏菌親緣關(guān)系較近的細(xì)菌反應(yīng)皆為陰性;靈敏度高，檢測牛、羊、豬、犬種布魯氏菌的靈敏度都達(dá)到102CFU/mL以上;重復(fù)性好，在試劑盒的批次內(nèi)和批次間檢測結(jié)果無差異。試劑盒存儲在-20

7、℃下，保存期為8個月。
　　試劑盒檢測牛、羊、豬種布魯氏菌模擬奶樣的靈敏度達(dá)到1.0×103CFU/mL，檢測犬種布魯氏菌模擬奶樣的靈敏度達(dá)到1.0×104CFU/mL，并能夠準(zhǔn)確檢測出小鼠脾臟感染的布魯氏菌種型。用本研究組裝的試劑盒和我國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的布魯氏菌PCR方法同時檢測牦牛和羊流產(chǎn)胎兒脾臟菌液樣本，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的布魯氏菌PCR方法只能鑒定到布魯氏菌屬的水平，無法區(qū)分種型。本研究組裝的試劑盒能夠進(jìn)一步對布魯氏