三種食源性病毒RT-PCR-反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法的建立.pdf

1、食源性病毒是引起食源性疾病的主要原因之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，發(fā)達(dá)國(guó)家每年約有30％的人口患食源性疾病，而在發(fā)展中國(guó)家每年患腹瀉及相關(guān)疾病的患者約有2.7億，導(dǎo)致240萬(wàn)5歲以下兒童死亡。輪狀病毒(Rotavrius，RV)、諾如病毒(Norovirus，NV)和甲型肝炎病毒(HapatitisA virus，HAY)是三種常見的食源性病毒，主要通過(guò)糞一口途徑在人與人之間傳播，水和食品污染病毒是它們最主要的傳播方式。
　　 輪狀病毒、

2、諾如病毒和甲型肝炎病毒均為RNA病毒。目前世界上對(duì)這三種病毒的檢測(cè)方法主要為電鏡法、ELISA法和RT-PCR法。但由于電鏡法價(jià)格昂貴，對(duì)環(huán)境及操作人員要求較高；ELISA的靈敏度不及RT-PCR，使得RT-PCR成為目前檢測(cè)輪狀病毒、諾如病毒和甲型肝炎病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究通過(guò)建立RT-PCR擴(kuò)增與反向斑點(diǎn)雜交檢測(cè)相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種病毒的同步檢測(cè)，即在RT-PCR擴(kuò)增之后利用反向斑點(diǎn)雜交方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。該方法不但能有效提高

3、檢測(cè)靈敏度、降低“假陽(yáng)性”風(fēng)險(xiǎn)，且檢測(cè)方法無(wú)需任何儀器、價(jià)格低廉、檢測(cè)結(jié)果肉眼可見，可用于對(duì)食品、糞便的快速定性篩查。論文主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 (1)采用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒法對(duì)病毒RNA進(jìn)行提取。以GII型諾如病毒的RNA依賴性的RNA聚合酶基因(RdRp)、輪狀病毒的A組內(nèi)衣殼蛋白VP6基因和甲肝病毒的VPI～VP3結(jié)構(gòu)蛋白基因?yàn)閿U(kuò)增對(duì)象，建立RT-PCR同時(shí)擴(kuò)增這三種病毒的方法

4、。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中引物濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)的優(yōu)化得到RT-PCR同時(shí)擴(kuò)增RV、NV和HAV的最佳反應(yīng)條件。并測(cè)得在此條件下利用瓊脂糖凝膠電泳法分析擴(kuò)增結(jié)果的最低檢測(cè)限為：279.3pg(RV)、93.7pg(NV)、117.3pg(HAV)。
　　 (2)回收輪狀病毒、諾如病毒和甲肝病毒的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)純化后用于構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-RV、pGEM-NV、pGEM-HAV。利用PCR及測(cè)序方法對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)分析，

5、并將克隆產(chǎn)物作為模板用于反向斑點(diǎn)雜交優(yōu)化試驗(yàn)中。
　　 (3)通過(guò)對(duì)反向斑點(diǎn)雜交反應(yīng)過(guò)程中雜交膜、堿性磷酸酶的稀釋度、RT-PCR產(chǎn)物加入量、紫外交聯(lián)時(shí)間、預(yù)雜交時(shí)間、雜交時(shí)間、雜交后洗膜時(shí)間及溫度、酶促反應(yīng)時(shí)間、酶促后洗膜時(shí)間和雜交溫度的探索及優(yōu)化建立了反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)同時(shí)檢測(cè)輪狀病毒、諾如病毒和甲肝病毒的方法。通過(guò)靈敏度試驗(yàn)得到該方法同時(shí)檢測(cè)RV、NV、HAV的最低檢測(cè)限。RV與NV的最低檢測(cè)限分別為27.93pg和9.37

6、pg，高于RT-PCR-凝膠電泳法10倍；HALV的最低檢測(cè)限為1.173pg，高于RT-PCR-凝膠電泳法100倍。且雜交穩(wěn)定性、特異性良好，無(wú)交叉反應(yīng)。
　　 (4)采集7份臨床樣本對(duì)本研究所建立的RT-PCR-反向斑點(diǎn)雜交法的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證，并與RT-PCR-凝膠電泳法進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，RT-PCR-反向斑點(diǎn)雜交法對(duì)于RV、NV和HAV三種食源性病毒的檢測(cè)可靠有效，檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR-凝膠電泳法一致，其中6份樣本呈