利用TILLING技術(shù)篩選油菜根毛突變體及根毛發(fā)生發(fā)育相關(guān)基因的分離.pdf

1、甘藍(lán)型油菜是重要的油料作物，缺磷導(dǎo)致油菜產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降。通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)從分子水平上揭示油菜對(duì)磷吸收、利用、分配的特性，能夠?yàn)橛筒说牧谞I(yíng)養(yǎng)機(jī)理研究及其性狀改良提供基礎(chǔ)。本研究以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的寧油7號(hào)EMS突變體庫(kù)為材料，根據(jù)擬南芥的基因信息，利用同源序列法和PCR－walking技術(shù)分離油菜中控制根毛發(fā)生發(fā)育的相關(guān)基因BnWER、Bn-AT5G49270和BnCPC。然后，根據(jù)序列分析確定的BnWER的兩個(gè)同源基因的差異設(shè)計(jì)基因

2、特異引物，利用TILLING（靶向篩選基因組局部點(diǎn)突變）技術(shù)篩選上述突變體庫(kù)得到了根毛突變體，并鑒定了根毛突變體與磷營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系。
　　 獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1．甘藍(lán)型油菜中BnWER，Bn-AT5G49270，BnCPC同源基因的分離。
　　 利用同源序列法和PCR-walking的方法在油菜中分離到與控制擬南芥根毛發(fā)生發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子WER同源的兩個(gè)全長(zhǎng)基因，分別命名為BnWER－1和BnWER-2，其同

3、源性為98％。BnWER-1與BnWER-2的差異在于：與BnWER-2相比，BnWER－1的第二個(gè)內(nèi)含子1355th bp處有26 bp（AGGGCCTGACTATATACTAGTTGTCT）片段的缺失。利用相同的方法分離得到控制擬南芥根毛發(fā)生發(fā)育的基因．AT5G49270在油菜中的同源基因，與擬南芥中該基因的同源性為86％。通過序列分析分離得到Bn-AT5G49270的兩個(gè)同源基因片段，其中一個(gè)同源基因片段有9 bp（CTGTATA

4、TA）的缺失。在油菜中分離得到控制擬南芥根毛發(fā)生發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子CPC的基因片段682 bp，與擬南芥中該基因的同源性為85％～93％。
　　 2．BnWER突變體的篩選。
　　 根據(jù)BnWER兩個(gè)同源基因之間的差異設(shè)計(jì)了兩對(duì)TILLIANG引物，分別為BnWER-1F/1R，BnWER-2F/2R。用這兩對(duì)引物篩選寧油7號(hào)EMS突變體庫(kù)2980個(gè)M2單株，共檢測(cè)到16個(gè)突變位點(diǎn)。對(duì)16個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的突變單株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)

5、行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)14個(gè)突變位點(diǎn)由G/C突變成了A/T，有2個(gè)突變位點(diǎn)是T突變成G。16個(gè)突變位點(diǎn)中有7個(gè)位于基因的內(nèi)含子位置，在翻譯的過程中被剪切，預(yù)測(cè)其對(duì)基因的功能沒有影響。位于外顯子的突變位點(diǎn)有9個(gè)，用PARSESNP程序預(yù)測(cè)表明，點(diǎn)突變對(duì)基因編碼氨基酸有影響。
　　 3．突變體表型的鑒定及評(píng)價(jià)突變體與磷吸收利用的關(guān)系。
　　 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn)表明，與野生型相比，突變體M273、M024、K413根毛數(shù)量和長(zhǎng)度沒有明顯的增