人工感染3種致病弧菌對大黃魚7種酶活性的影響【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　人工感染3種致病弧菌對大黃魚7種酶活性的影響</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　目錄

3、 </p><p>　　摘要（Abstract） </p><p>　　1.引言...............................

4、...........................................................................................................................................1 </p><p>　　2.材料與方法..............................................

5、................................................................................................................2 </p><p>　　2.1實驗材料............................................................................

6、...........................................................................2</p><p>　　2.1.1 實驗用魚...............................................................................................................

7、............................2</p><p>　　2.1.2 實驗菌株...........................................................................................................................................2</p><p&

8、gt;　　2.1.3 試劑...................................................................................................................................................2</p><p>　　2.1.4 儀器............................

9、.......................................................................................................................2</p><p>　　2.2 實驗方法.....................................................................

10、.................................................................................2</p><p>　　2.2.1 各菌株感染濃度的確定...................................................................................................

11、................2</p><p>　　2.2.2 實驗分組...........................................................................................................................................3</p><p>　　2.2.3 菌

12、懸液的配置...................................................................................................................................3</p><p>　　2.2.4 人工感染..................................................

13、.........................................................................................3</p><p>　　2.2.5 樣品采集.................................................................................................

14、..........................................3</p><p>　　2.2.6 血清溶菌酶活性測定.......................................................................................................................3</p><p&g

15、t;　　2.2.7 血清酚氧化酶活性的測定...............................................................................................................3</p><p>　　2.2.8 血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的測定................................

16、.....................................3</p><p>　　2.2.9 數(shù)據(jù)處理...........................................................................................................................................4</p>

17、;<p>　　3.結(jié)果和分析............................................................................................................................................................4</p><p>　　3.1 血清溶菌酶（LSZ)活性變化.

18、....................................................................................................................4</p><p>　　3.2 血清酚氧化酶(PO)活性變化..............................................................

19、........................................................4</p><p>　　3.3 血清超氧化物歧化酶(SOD)活性變化.......................................................................................................5</p>&l

20、t;p>　　3.4 血清酸性磷酸酶(ACP)活性變化...............................................................................................................5</p><p>　　3.5 血清堿性磷酸酶(AKP)活性變化....................................

21、...........................................................................6</p><p>　　3.6 血清髓過氧化物酶(MPO)活性變化....................................................................................................

22、......7</p><p>　　3.7 血清過氧化物酶(POD)活性變化...............................................................................................................7</p><p>　　4.討論...............................

23、..........................................................................................................................................7</p><p>　　5.結(jié)論與展望...................................................

24、..........................................................................................................9</p><p>　　致謝........................................................................................

25、....................................................................................9</p><p>　　參考文獻(xiàn)............................................................................................................

26、......................................................10</p><p>　　摘要：目前頻發(fā)的大黃魚潰瘍病主要由溶藻弧菌、哈維氏弧菌以及副溶血弧菌引起。本實驗將健康的大黃魚分為3個實驗組和1個對照組，分別注射0.2 ml的哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及滅菌生理鹽水，并在人工感染后的0，1，2，4，7，10，13，16，20 d分別采樣，通過測定每組大黃魚

27、血清中7種免疫相關(guān)酶活性，比較這3種致病弧菌毒性差異及對大黃魚非特異性免疫功能的影響。結(jié)果顯示：在感染后的1～10 d，每個實驗組的大黃魚血清中LSZ、ACP、POD、MPO的活性變化，總體表現(xiàn)為先升高、后降低再逐漸升高最后趨于一致的現(xiàn)象，且不同病原菌之間存在一定的時效差異。 AKP、PO、SOD和LSZ對入侵體內(nèi)的哈氏弧菌反應(yīng)較敏感，ACP、SOD、POD和MPO對入侵體內(nèi)的溶藻弧菌反應(yīng)較敏感，LSZ、ACP和PO對入侵體內(nèi)的副溶血弧

28、菌反應(yīng)較敏感。</p><p>　　關(guān)鍵詞：大黃魚； 溶藻弧菌； 哈維氏弧菌； 副溶血弧菌； 酶活性</p><p>　　Effects of experimental infection with three pathogenic vibrio on seven enzymes in Pseudosciaena crocea（Richardson）</p><p&g

29、t;　　Abstract: The ulcer disease ,widely spread on the large yellow croaker ,is mainly caused by Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi and Vibrio parahaemolyticus according to the researches. In this paper , we set 3 exper

30、imental groups with the injection of 0.2 ml Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus, respectively, while injecting the same dose of sterile saline for the control group. Then Sampled at 0,1,2,4,7

31、,10,13,16 and 20 days after infection. By measuring the activity</p><p>　　1 引言 大黃魚Pseudosciaena crocea（Richardson）隸屬鱸行目，石首魚科，黃魚屬，俗稱黃魚、黃瓜魚、黃花魚，是我國主要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一。隨著大黃魚人工育苗技術(shù)的完善，其養(yǎng)殖規(guī)模也迅速擴(kuò)大，但由于養(yǎng)殖密度的加大及日常不科學(xué)的管理措施

32、，疾病的流行和危害也日益嚴(yán)重，威脅著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。這包括長期近親繁殖導(dǎo)致種質(zhì)的退化，病害防治用藥上有些養(yǎng)殖戶或一些漁病防治員為了快速治好魚病或為了賺錢, 不顧農(nóng)業(yè)部頒布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理規(guī)定》(31號令) , 未確定病原或病因而盲目大量使用禁用漁藥或抗生素等, 甚至使用人用的新藥, 形成濫用漁藥的局面，都加大了病害發(fā)生率。 目前已鑒定出的大黃魚細(xì)菌性病原有溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶

33、血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、鰻弧菌（V.anguillarum）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、河流弧菌（V.fluvialis）、腐敗假單胞菌（Pseudomonas putrefaciens）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas </p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><

34、;b>　　2.1 實驗材料</b></p><p>　　2.1.1 實驗用魚</p><p>　　大黃魚來自浙江寧波象山黃避岙養(yǎng)殖海區(qū)，選擇體表無明顯傷痕，體重250～300 g之間，攝食正常的健康大黃魚。</p><p>　　2.1.2 實驗菌株</p><p>　　哈維氏弧菌(V.harveyi)、溶藻弧菌(V.algi

35、nolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等菌株，均分離自患病大黃魚，并經(jīng)回歸感染試驗證明具有較強毒力(金 珊，2005)，保存于本實驗室。溶壁微球菌(Micrococcus lysoleikticus)購置sigma公司。</p><p><b>　　2.1.3 試劑</b></p><p>　　L-多巴(上海伯奧生物科技公司)<

36、/p><p><b>　　2.1.4 儀器</b></p><p>　　電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9082型)；sunrise吸光酶標(biāo)儀；恒溫水浴鍋；紫外分光光度計。</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 各菌株感染濃度的確定</p><

37、p>　　將保存的哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分別接種于50%海水營養(yǎng)瓊脂斜面上，28 °C恒溫培養(yǎng)24 h后，用0.85%無菌生理鹽水洗下菌苔，先經(jīng)比濁法計數(shù)，最終采用平板傾注法計數(shù)活菌數(shù)。將各種菌液濃度調(diào)整至109 CFU·ml-1左右，再稀釋成106，107，108 3個梯度的菌懸液，備用。將健康大黃魚隨機(jī)分為4組，每組10尾，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組分別腹腔注射上述備用的106，107，108 3個濃度的菌懸

38、液，每尾注射0.2 ml，Ⅳ組注射0.2 ml滅菌的生理鹽水。觀察注射后1～2周內(nèi)各感染組魚的死亡情況，最終確定試驗時哈氏弧菌感染濃度為106 CFU·ml-1，溶藻弧菌和副溶血弧菌感染濃度為107 CFU·ml-1。</p><p>　　2.2.2 實驗分組</p><p>　　購買的健康大黃魚隨機(jī)分成四組，放養(yǎng)于浙江省寧波市象山縣黃避岙海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚排，網(wǎng)箱規(guī)格3

39、m×3 m×3 m，試驗期間水溫：(28±1) ℃，海水鹽度：28，每組放養(yǎng)80尾，正常投喂，暫養(yǎng)1 周后開始實驗。</p><p>　　2.2.3 菌懸液的配置</p><p>　　(1) 50%海水營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱取普通營養(yǎng)瓊脂商品培養(yǎng)基33 g，溶于500 ml蒸餾水中，加入500 ml陳海水，加熱攪拌，煮沸至完全溶解，在高壓蒸氣10549.86

40、 kg/m2 下滅菌20 min，最終pH為7.3±0.1，做無菌試驗后備用。</p><p>　　(2) 菌液配制：將保存的哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分別接種于50%海水營養(yǎng)瓊脂斜面上，28°C恒溫培養(yǎng)24 h后，用0.85%無菌生理鹽水洗下菌苔，先經(jīng)比濁法計數(shù)，調(diào)整哈氏弧菌菌液濃度至106 CFU·ml-1，調(diào)整溶藻弧菌和副溶血弧菌菌液濃度至107 CFU·ml-

41、1。</p><p>　　(3) 菌液濃度計算：采用平板傾注法，10倍稀釋各組菌懸液，分別吸取稀釋10-4、10-5和10-6的菌懸液進(jìn)行平板傾注，然后在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24~28 h后進(jìn)行計數(shù)，計算感染所用各種菌懸液的活菌濃度。</p><p>　　2.2.4 人工感染</p><p>　　大黃魚用丁香酚麻醉后，進(jìn)行腹腔注射感染，實驗組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ分別注射

42、哈氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血弧菌，每尾注射0.2 ml上述對應(yīng)菌懸液，對照組Ⅳ每尾注射0.2 ml滅菌的生理鹽水。試驗期間各組大黃魚均未發(fā)生死亡現(xiàn)象。</p><p>　　2.2.5 樣品采集</p><p>　　在感染后第0 d，1 d，2 d，4 d，7 d，10 d，13 d，16 d，20 d分別從各感染組與對照組隨機(jī)各取6尾大黃魚，采用一次性注射器，尾靜脈取血，各組制備三個平行血

43、樣后進(jìn)行7種酶指標(biāo)檢測。</p><p>　　2.2.6 血清溶菌酶活性的測定</p><p>　　采用Hultmark等(1980)的方法：以溶壁微球菌為底物，將該菌用0.1 mol/L、pH 6.4的磷酸鉀鹽緩沖液配成A570≈0.3的菌懸液，取3.0 mL該菌懸液與200 μL待測血清于試管中混勻，于570 nm處測定其A0，然后將試管置于37℃水浴保溫30 min，然后取出立即置冰

44、浴中10 min以終止反應(yīng)，測定其A值，溶菌活力UL按下式計算：UL= (A0-A)/A.</p><p>　　2.2.7 血清酚氧化酶活性的測定</p><p>　　以L-多巴為特異性底物，采用改進(jìn)的Ashida等(1971)方法在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行。在96孔酶標(biāo)板中加入10 μl血清，然后向各孔中加入200 μl 0.1 mol/L pH 6.0磷酸鉀緩沖液，最后向各樣品孔中加入10

45、μl的L-DOPA液(0.01 mol/L)，在酶標(biāo)儀中振蕩4次混勻，每隔4 min讀取490 nm處的吸光值(OD)。在該試驗條件下，將每分鐘OD值增加0.001作為一個酶活力單位。</p><p>　　2.2.8 血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的測定</p><p>　　根據(jù)購自南京建成生物技術(shù)研究所的試劑盒，分別測定試驗組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和對照組大黃魚血清中，髓過氧化物酶(

46、MPO)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超過氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的活性。</p><p>　　2.2.9 數(shù)據(jù)處理</p><p>　　對于試驗所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2003軟件進(jìn)行整理和作圖；試驗結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計學(xué)分析；各組處理平均數(shù)之間采用LSD檢驗方法進(jìn)行差異顯著性比較。</p><p>&l

47、t;b>　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 血清溶菌酶(LSZ)活性變化</p><p>　　血清溶菌酶活性變化趨勢見圖1。在感染后1 d時，實驗組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)均極顯著高于對照組(P<0.01)，而實驗組Ⅲ與實驗組Ⅰ、Ⅱ之間均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。1～2 d內(nèi)，各實驗組略有下降與對照組差異顯著(P<0.05)。2 d后，副溶

48、血弧菌感染組有較大上升趨勢，在第4 d極顯著高于對照組(P<0.01)。7 d時，實驗組Ⅰ溶菌酶活力與對照組差異顯著(P<0.05)，實驗組Ⅱ、Ⅲ與對照組差異不顯著(P>0.05)。10 d時，實驗組Ⅱ有所下降與對照組差異顯著(P<0.05)，與實驗組Ⅲ之間也存在顯著差異(P<0.05)。10 d以后變化趨勢不明顯。結(jié)果顯示各實驗組之間，副溶血弧菌對大黃魚溶菌酶活性影響較為明顯。</p>&l

49、t;p>　　圖1 3種致病弧菌對大黃魚血清溶菌酶活性的影響</p><p>　　Fig. 1 Effects of three pathogenic vibrio on Lysozyme activity in P.crocea</p><p>　　注：圖中同組有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。</p>

50、;<p>　　3.2 血清酚氧化酶(PO)活性變化</p><p>　　血清酚氧化酶活性變化趨勢見圖2。1 d時，各實驗組酚氧化酶活性顯著上升與對照組差異極顯著(P<0.01)；實驗組Ⅲ上升幅度最大，與實驗組Ⅰ差異顯著(P<0.05)，與實驗組Ⅱ差異極顯著(P<0.01)。2 d時，各組酶活性下降明顯，實驗組Ⅲ顯著高于對照組(P<0.05)。4 d時，實驗組Ⅲ持續(xù)下降，顯著低

51、于對照組(P<0.05)，與實驗組Ⅱ之間也存在顯著差異(P<0.05)。7 d以后各實驗組酚氧化酶活性基本恢復(fù)正常，與對照組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示感染后血清酚氧化酶活性在1～4 d內(nèi)發(fā)生了明顯的變化，不同病原菌之間存在一定的時效差異。</p><p>　　圖2 3種致病弧菌對大黃魚血清酚氧化酶酶活性的影響</p><p>　　Fig. 2 Effect

52、s of three pathogenic vibrio on phenoloxidase activity in P.crocea</p><p>　　3.3 血清超氧化物岐化酶(SOD)活性變化 血清超氧化物歧化酶活性變化趨勢見圖3。1 d時，實驗組Ⅰ、Ⅱ超氧化物歧化酶活性降低，與實驗組Ⅲ，對照組差異極顯著(P<0.01)。2 d時，各實驗組與對照組差異都不不顯著(P>0.05)，而實驗組

53、Ⅰ與Ⅱ之間存在顯著差異(P<0.05)。7 d時，實驗組Ⅰ與對照組差異顯著(P<0.05)?？傮w反應(yīng)各實驗組超氧化物歧化酶活性變化不顯著。</p><p>　　圖3 3種致病弧菌對大黃魚血清超氧化物岐化酶活性的影響</p><p>　　Fig. 3 Effects of three pathogenic vibrio on superoxide dismutase act

54、ivity in P.crocea</p><p>　　3.4 血清酸性磷酸酶(ACP)活性變化 血清酸性磷酸酶活性變化趨勢見圖4。1 d時，各實驗組血清酸性磷酸酶的活力下降，與對照組差異不顯著(P>0.05)。2 d時，實驗組Ⅱ顯著上升，與對照組和實驗組Ⅰ、Ⅲ都存在極顯著差異(P<0.01)。4 d時，實驗組Ⅱ與對照組差異顯著(P<0.05)。7 d時，各實驗組都有所下降，實驗組Ⅰ極顯

55、著低于對照組和實驗組Ⅱ、Ⅲ(P<0.01)，實驗組Ⅲ顯著低于對照組(P<0.05)。10 d時，實驗組Ⅰ、Ⅲ顯著低于對照組(P<0.05)，而實驗組Ⅱ顯著高于對照組(P<0.05)。13 d時，實驗組Ⅰ、Ⅲ活性上升。13 d以后，各組水平基本趨于一致。結(jié)果反應(yīng)溶藻弧菌對酸性磷酸酶活性的影響最為明顯。</p><p>　　圖4 3種致病弧菌對大黃魚血清酸性磷酸酶活性的影響Fig. 4

56、Effects of three pathogenic vibrio on acid phosphatase activity in P.crocea</p><p>　　3.5 血清堿性磷酸酶（AKP)活性變化</p><p>　　堿性磷酸酶活性變化趨勢見圖5。1 d時，實驗組Ⅰ堿性磷酸酶活性顯著低于實驗組Ⅱ、Ⅲ和對照組(P<0.05)。2 d時，各實驗組與對照組差異均不顯著(P&

57、gt;0.05)。4 d時，實驗組Ⅰ明顯上升與對照組差異極顯著(P<0.01)，與實驗組Ⅱ、Ⅲ也存在極顯著差異(P<0.01)。7 d時，實驗組Ⅰ極顯著低于對照組和實驗組Ⅱ、Ⅲ(P<0.01)。10 d時，實驗組Ⅲ下降趨勢明顯，與對照組及實驗組Ⅰ、Ⅱ均存在顯著差異(P<0.05)。10 d以后各實驗組之間無顯著差異。結(jié)果顯示3種致病細(xì)菌對大黃魚血清堿性磷酸酶的活性變化存在較大差異。</p><

58、p>　　圖5 3種致病弧菌對大黃魚血清堿性磷酸酶活性的影響</p><p>　　Fig. 5 Effects of three pathogenic vibrio on alkaline phosphatase activity in P.crocea</p><p>　　3.6 血清髓過氧化物酶(MPO)活性變化</p><p>　　血清髓過氧化物酶

59、活性變化趨勢見圖6。實驗組Ⅰ在感染后1～2 d內(nèi)，髓過氧化物酶活性與對照組差異不顯著(P>0.05)，4 d時顯著低于對照組(P<0.05)，7 d后與對照組基本保持一致。實驗組Ⅱ在感染后1～10 d內(nèi)，髓過氧化物酶活性變化較為明顯，主要呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第1 d、4 d顯著高于對照組(P<0.05)，在第2 d、7 d極顯著高于對照組(P<0.01)，第10 d時顯著低于對照組(P<0.05)，1

60、0 d以后與對照組差異不顯著。實驗組Ⅲ髓過氧化物酶活性變化不明顯，與對照組差異不顯著。</p><p>　　圖6 3種致病弧菌對大黃魚血清髓過氧化物酶活性的影響 </p><p>　　Fig. 6 Effects of three pathogenic vibrio on myeloperoxidase activity in P.crocea</p><p

61、>　　3.7 血清過氧化物酶(POD)活性變化</p><p>　　血清過氧化物酶活性變化趨勢見圖7。1 d時，實驗組Ⅰ過氧化物酶活性降低，與對照組差異顯著(P<0.05)，與實驗組Ⅱ、Ⅲ存在極顯著差異(P<0.01)。2 d時，實驗組Ⅲ活性明顯降低，顯著低于對照組(P<0.05)，實驗組Ⅰ、Ⅱ與對照組無顯著差異(P＞0.05)。4 d時，實驗組Ⅰ顯著高于實驗組Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)

62、。7 d時，實驗組Ⅰ顯著低于實驗組Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)。10 d時，實驗組Ⅱ顯著高于對照組和實驗組Ⅰ、Ⅲ(P<0.05)。13 d后各組水平基本趨于一致。</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　魚體內(nèi)的酶主要分布于組織細(xì)胞中。在正常情況下，血清中酶活性較低且相對恒定。當(dāng)組織發(fā)生損傷時，細(xì)胞中的一些酶會大量逸出進(jìn)入血淋巴導(dǎo)致血清

63、中酶活性發(fā)生改變。因此通過測定血清中酶的活性變化可以反映魚體的生理狀態(tài)。</p><p>　　酚氧化酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶等都是免疫酶，是評價魚類非特異性免疫能力的指標(biāo)。當(dāng)病原菌進(jìn)入魚體后，首先引起機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)。隨著吞噬細(xì)胞的吞噬作用，溶酶體分泌溶酶體酶，以防御病原菌對魚體的損傷。溶酶體酶主要包括溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)，這些酶在非特異性免疫應(yīng)答中起

64、著重要作用。</p><p>　　圖7 3種致病弧菌對大黃魚血清過氧化物酶活性的影響 Fig. 7 Effects of three pathogenic vibrio on peroxidase activity in P.crocea</p><p>　　溶菌酶作為魚類重要的非特異性免疫因子，在魚體抵抗感染性致病菌的最前沿起著重要作用(Christopher，2001)。溶菌

65、酶是一種能水解黏多糖的堿性酶，能水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的黏多糖，使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、細(xì)菌內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌死亡，起到防御的功能。因此對于抵抗各種病原體的侵襲、增強疾病的抵抗力方面具有重要意義(王宏田，2000)。孫峰等(2005)曾研究了人工感染嗜水氣單胞菌后鯽魚體內(nèi)溶菌酶活性的變化。該研究表明，機(jī)體在受到外來病原菌感染時，吞噬細(xì)胞能夠合成和釋放出更多的溶菌酶，提高了溶解病菌的能力。本實驗中，大黃魚在感染3種致

66、病弧菌后的第1～7 d內(nèi)溶菌酶活性變化較為明顯，各實驗組溶菌酶活性變化總體表現(xiàn)出先升高、后略有降低接著又逐漸升高最后趨于一致的趨勢。其主要原因可能是感染初期魚體受到病原菌的刺激導(dǎo)致一些免疫細(xì)胞的活性增加，以致分泌溶菌酶的能力增強，使血清中溶菌酶的濃度升高，從而增加了對病原菌的溶解能力；但隨著刺激的不斷增強，溶菌酶分泌受到抑制，活性有所降低；而隨著魚體自身免疫系統(tǒng)的不斷調(diào)節(jié)，溶菌酶活性又開始上升；第10 d以后溶菌酶活性變化不顯著，這可&

67、lt;/p><p>　　磷酸酶是動物體內(nèi)普遍存在且與動物生命活動密切相關(guān)的酶系，它參與動物體內(nèi)物質(zhì)的吸收運轉(zhuǎn)、生長分化、分泌等多種生理活動。堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)也是溶酶體酶的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用(肖克宇，2007)。本實驗結(jié)果表明，各實驗組的大黃魚在感染后第2～13 d內(nèi)ACP活性變化較為明顯，主要呈現(xiàn)出先升高，后略有下降然后又逐漸升高的趨勢，與溶菌酶活性變化趨勢類似。其中溶

68、藻弧菌對大黃魚血清中ACP活性影響最顯著。3種致病弧菌對大黃魚血清AKP活性變化主要表現(xiàn)為：哈氏弧菌感染組先下降后顯著上升，然后再有所下降之后變化不明顯，而溶藻弧菌感染組和副溶血弧菌感染組活性變化總體變現(xiàn)為不顯著。不同菌種對大黃魚酶的影響存在差異性：ACP活性變化對溶藻弧菌較為敏感，AKP活性變化對哈氏弧菌較為敏感。</p><p>　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是一種重要

69、的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子(O-2)的歧化作用，產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)和氧(O2)，促使機(jī)體自由基的形成和清除處于動態(tài)平衡。超氧化物歧化酶在對延緩機(jī)體衰老、防止生物大分子損傷等方面具有重要作用。此外，SOD還具有抗菌、抗病毒等效果。已有研究表明：SOD活性與生物免疫機(jī)能密切相關(guān)，對于增強吞噬細(xì)胞的防御能力及整個機(jī)體的免疫功能有重要作用(Zegers，1999)。本試驗結(jié)果表明，各實驗組在感染后的1～2 d內(nèi)SOD活性有所下降。當(dāng)S

70、OD活性降低時，機(jī)體內(nèi)自由基等毒害物質(zhì)就會積累，細(xì)胞便可能受到損傷；2 d后SOD活性有所升高，但整體變化不明顯，說明3種致病弧菌對大黃魚超氧化物歧化酶活性影響不明顯。</p><p>　　過氧化物酶(POD)是一種氧化還原酶，主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中。過氧化物酶體含有豐富的酶類，其主要作用是將過氧化氫等細(xì)胞毒性物質(zhì)分解，對細(xì)胞起到保護(hù)作用。過氧化物酶體普遍存在于真核生物的各類細(xì)胞中，尤其是在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞

71、中數(shù)量特別多，另外過氧化物酶體還具有解毒作用。髓過氧化物酶(MPO)是一種催化過氧化物還原的酶，通過將過氧化氫和氯離子變?yōu)榇温人醽淼挚雇鈦砦镔|(zhì)，對各種病原菌具有很強的功效。從某些方面來看，過氧化物酶與髓過氧化物酶具有相似的生化性質(zhì)，都有一定抗菌活性。本實驗結(jié)果顯示，各實驗組血清中過氧化物酶活性的變化與髓過氧化物酶活性的變化也存在相似性。其影響主要發(fā)生在感染后的1～10 d，表現(xiàn)出先上升，后下降然后再有所上升的趨勢，說明大黃魚血清抗菌活性

72、隨感染時間的延長發(fā)生了一定變化。另外各實驗組酶活性變化也存在差異性，溶藻弧菌對POD和MPO較為敏感，酶活性變化幅度較大。 </p><p>　　酚氧化酶(PO)是無脊椎動物重要的非特異性免疫因子，從氧化酶原(proPO)被激活到產(chǎn)生黑色素這個過程中往往伴隨呼吸爆發(fā)(李國榮，2003)。在某些研究中發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶活性在病原菌物入侵時有所提高(簡紀(jì)常，2004；楊文鴿，2006；)。本實驗結(jié)果也與之相符：各實

73、驗組大黃魚血清中PO活性在感染初期顯著提高，增加了其免疫防御作用，而7 d以后各實驗組酚氧化酶活性基本恢復(fù)正常。</p><p><b>　　5 結(jié)論與展望</b></p><p>　　本實驗首次比較了引起大黃魚潰瘍病的三種致病弧菌對其機(jī)體損傷的毒力差異，以及對大黃魚血清中7種免疫相關(guān)酶影響的差異性和相關(guān)性。</p><p>　　研究表明大黃魚

74、被感染后，血清中7種免疫酶活性的變化均主要發(fā)生在病原菌感染前期，說明非特異性免疫因子在感染的早期階段起主要作用。</p><p>　　3種致病弧菌對大黃魚血清中各種酶活性的影響也存在差異性：AKP、PO、SOD和LSZ對入侵體內(nèi)的哈氏弧菌反應(yīng)較敏感，ACP、SOD、POD和MPO對入侵體內(nèi)的溶藻弧菌反應(yīng)較敏感，LSZ、ACP和PO對入侵體內(nèi)的副溶血弧菌反應(yīng)較敏感。這些酶在魚體抗感染非特異性免疫的啟動和效應(yīng)過程中發(fā)

75、揮積極作用，也為養(yǎng)殖大黃魚弧菌病早期檢測指標(biāo)的選擇提供了參考依據(jù)。</p><p>　　相信，隨著對各種致病菌的致病機(jī)理，病原來源、侵入途徑及對機(jī)體致病作用方式的更進(jìn)一步研究；同時對大黃魚免疫功能基礎(chǔ)研究的深入，特別是對大黃魚抗病原菌感染的免疫反應(yīng)機(jī)理的了解，能對其疾病防御提供重要的理論基礎(chǔ)，且為將來各類免疫增強劑的篩選以提高大黃魚自身免疫抗病力奠定基礎(chǔ)，這對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展和保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全都有重要

76、的意義。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陳昌福,羅宇良,蔡冰,等.飼養(yǎng)水溫對草魚溶菌酶活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué),1996,3(3):26-28.</p><p>　　[2] 簡紀(jì)常,吳灶和.大黃魚庫道蟲病的初步研究[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報,2003,23(1):29-34.</p>

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