新型降膽固醇酸奶的研制【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　新型降膽固醇酸奶的研制</p><p>　　一、選題的背景與意義</p><p>

2、;　　膽固醇在體內(nèi)具有重要的生理功能，是人體不可缺少的物質(zhì)。它是細胞膜組成構(gòu)件之一，與生物膜的通透性和神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)，同時也是形成類膽固醇激素、膽汁酸以及維生素D3的前體物質(zhì)。</p><p>　　營養(yǎng)專家認為每人的膽固醇攝入量應(yīng)低于300 mg/d，但由于人們生活水平的提高和不良的飲食習(xí)慣，人體膽固醇的攝入量很容易過量。過高的膳食膽固醇攝入可導(dǎo)致血清膽固醇水平的升高，嚴重者將誘發(fā)高脂血癥，進而導(dǎo)致腦卒中、冠心病、

3、心肌梗死、猝死等。</p><p>　　1974年，Mann和Spoerry發(fā)現(xiàn)非洲Masai人大量飲用由乳酸菌發(fā)酵的乳制品，其體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低；1978年，他們調(diào)查了經(jīng)常消費酸奶和發(fā)酵乳制品的美國人，發(fā)現(xiàn)這類人群體內(nèi)血清膽固醇的含量也很低。這個重大發(fā)現(xiàn)引起了國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等各界人士的廣泛關(guān)注，從而掀起了乳酸菌降膽固醇作用研究的熱潮。經(jīng)過國內(nèi)外研究人員三十多年的研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌確實可以起到

4、很好的降膽固醇效果。開發(fā)可降低人體膽固醇的食品已成為當(dāng)前的熱點課題之一。目前歐美和日本市場上已經(jīng)有類似的具有降低血清膽固醇的益生乳酸菌制品，但國內(nèi)鮮有報道。《中國心血管病報告》（2007）估計我國現(xiàn)有高血壓患者2億，腦卒中700萬，心肌梗死200萬，心力衰竭420萬；每年心臟性猝死54萬，為全球之首；每10個成年人中就有2人是心血管病，每10.5秒就有1人死于心血管病。所以，在我國開發(fā)新型降膽固醇發(fā)酵乳制品，具有廣闊的市場前景；另一方面

5、，這可改善我國乳制品種類比較單一的現(xiàn)狀，同時帶動農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展，增加農(nóng)業(yè)收入，從長遠來看，也有利于人們健康水平的提高。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p>　　1 將實驗室保存的、具有降膽固醇活性的乳酸菌菌株進行活化；然后運用活化菌種制備發(fā)酵劑。</p><p>　　2 研究具有降膽固醇活性的菌株在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中的應(yīng)用：先進行

6、單因素試驗，研究接菌量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等因素對發(fā)酵乳制品的品質(zhì)影響，在此基礎(chǔ)上進行正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，開發(fā)出口感較好的降膽固醇發(fā)酵乳制品；</p><p>　　3 在最佳發(fā)酵工藝條件下，測定酸奶的膽固醇降解率，判斷優(yōu)化前后其膽固醇降解率是否有所提高。</p><p><b>　　需解決的問題有：</b></p><p>　　如何用保存菌株

7、發(fā)酵酸奶；</p><p>　　酸奶發(fā)酵的工藝優(yōu)化；</p><p>　　如何測定酸奶的膽固醇降解率等。</p><p>　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p>　　1將實驗室保存的、具有降膽固醇活性的乳酸菌菌株進行活化，然后制備發(fā)酵劑；</p><p>　　2 運用發(fā)酵劑制備降膽固醇酸奶，并進行條件優(yōu)化<

8、;/p><p>　?、?以酸奶感官評定（組織狀態(tài)、風(fēng)味、凝乳情況）、酸度等為指標，考查接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度等單因素對酸奶品質(zhì)的影響；</p><p>　?、?在單因素實驗的基礎(chǔ)上選擇恰當(dāng)?shù)囊蛩胤秶M行正交試驗，找到最佳的發(fā)酵條件和工藝。</p><p>　　3 在第2步確定的最佳發(fā)酵條件下，進行體外降膽固醇實驗，測定該酸奶的膽固醇降解率，并與未進行條件優(yōu)化之前的膽

9、固醇降解率做比較。</p><p><b>　　技術(shù)路線：</b></p><p>　　菌種活化→制備發(fā)酵劑→發(fā)酵酸奶→單因素試驗→正交試驗→確定最佳發(fā)酵工藝→酸奶的膽固醇降解率測定</p><p>　　四、研究的總體安排與進度：</p><p>　　2010年12月～期末：查找資料并設(shè)計實驗方案</p>

10、<p>　　2011年2月～3月：活化菌種（實驗室保存菌種），研制新型降膽固醇酸奶：進行單因素（接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度）試驗</p><p>　　2011年3月～4月：進行正交試驗，并對比優(yōu)化前后的酸奶膽固醇降解率</p><p>　　2011年4月～5月：整理實驗資料并撰寫論文</p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b&g

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16、食品機械,2009,27(5):99～102</p><p>　　[13] Xiao J Z,Kondo S,Takahashi N,et al.Effects of milk products fermented by Bifidobacterium longumon blood lipids in rats and healthy adultmale volunteers[J].J Dairy Sci,200

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20、,蔣能群.植物乳桿菌ST-Ⅲ對實驗性動物高膽固醇血癥影響的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2004, (4): 150～152.</p><p>　　[22] 鄧凱波,柳國霞,霍貴成等.乳酸菌膽酸鹽耐受性及降膽固醇能力研究[J].食品工業(yè)科技,2010,(1):186～188</p><p>　　[23] 呂兵,張國農(nóng),楊瑞歡.嗜酸乳桿菌生物學(xué)特性及其發(fā)酵乳的研究[J].中國乳品工業(yè),2002

21、,30(5):37～39</p><p>　　[24] 張麗萍,楊晨,王成強等.干酪乳桿菌在酸奶生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J].中國乳品工業(yè),2007,35 (2):23～26</p><p>　　[25] 楊瑤,曾小群,潘道東.降膽固醇活性發(fā)酵乳桿菌F1發(fā)酵酸乳制備條件的研究[J].食品科學(xué),2010,31 (9):126～130</p><p>　　[26] 羅磊,陶健

22、,謝新華. 嗜酸乳桿菌發(fā)酵乳的研究[J].食品工業(yè),2003, (1):18～19</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　降膽固醇發(fā)酵乳制品的研究進展</p><p>　　摘要: 本文簡要敘述了乳酸菌降膽固醇作用

23、的發(fā)現(xiàn)及研究、應(yīng)用現(xiàn)狀，并簡單介紹了有關(guān)乳酸菌降膽固醇的作用機理，最后闡述了研制降膽固醇發(fā)酵乳制品的意義。</p><p>　　關(guān)鍵詞: 乳酸菌 降膽固醇 發(fā)酵乳制品</p><p><b>　　0前言</b></p><p>　　膽固醇在體內(nèi)具有重要的生理功能，是人體不可缺少的物質(zhì)。它是細胞膜組成構(gòu)件之一，與生物膜的通透性和神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)，同時

24、也是形成類膽固醇激素、膽汁酸以及維生素D3的前體物質(zhì)[1,2]。膽固醇分為低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。人體血液中的甘油三脂（TG）和膽固醇構(gòu)成了血清總膽固醇（TC）。營養(yǎng)專家認為每人的膽固醇攝入量應(yīng)低于300 mg/d[3]，但由于人們生活水平的提高和不良的飲食習(xí)慣，人體膽固醇的攝入量很容易過量。過高的膳食膽固醇攝入可導(dǎo)致血清膽固醇水平的升高，而高血清膽固醇是誘發(fā)動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓等心血

25、管疾病的重要因素[4,5]。如以正常膽固醇水平為基礎(chǔ)，血清膽固醇每升高1 mmol，機體患冠心病的危險大約增加35%，冠心病死亡的危險增加45%；血清膽固醇每減少1%，患冠心病的危險性就降低2%~3%[6 ]。因此開發(fā)可降低人體膽固醇的食品是當(dāng)前研究的熱點課題之一。</p><p><b>　　1. 材料來源</b></p><p>　　實驗室保存有一定數(shù)量的乳酸菌菌

26、株，它們是從新疆牧民制作的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和自然界中篩選出來的，有研究表明這些菌株有一定的降膽固醇活性。本課題擬以這些菌株為基礎(chǔ)，結(jié)合乳制品發(fā)酵試驗，開發(fā)出具有降膽固醇功能的高品質(zhì)發(fā)酵乳制品。</p><p>　　2 乳酸菌降膽固醇作用的發(fā)現(xiàn)、研究與應(yīng)用</p><p>　　2.1 乳酸菌降膽固醇作用的發(fā)現(xiàn)</p><p>　　1974年，Mann和Spoerry[7

27、 ]發(fā)現(xiàn)非洲Masai人大量飲用由乳酸菌發(fā)酵的乳制品，其體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低；四年后，他們又調(diào)查了經(jīng)常消費酸奶和發(fā)酵乳制品的美國人，發(fā)現(xiàn)這類人群體內(nèi)血清膽固醇的含量也很低。他們的調(diào)查發(fā)現(xiàn)引起了國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等各界人士的廣泛關(guān)注，從而掀起了乳酸菌降膽固醇作用研究的熱潮。</p><p>　　2.2 乳酸菌降膽固醇作用的研究</p><p>　　1985年，Gil

28、liland[8]通過給豬喂飼含有嗜酸乳桿菌的脫脂乳，發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制血清中膽固醇的增高。1992年，Rasic 等[9]也證實了嗜酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌對膽固醇有脫除作用。后來，Usman 和Hosono[10]、Hendriks 等[11]、Xiao 等[12]分別用加氏乳桿菌、干酪乳桿菌和雙歧桿菌進行動物實驗，驗證了它們降膽固醇的效果。Chiu [13]等人用降膽固醇乳酸菌制得的酸奶喂養(yǎng)倉鼠，結(jié)果顯示倉鼠血液和肝臟的膽固醇均明顯降

29、低。</p><p>　　國內(nèi)對于這方面的研究起步較晚，但是在近十年內(nèi)發(fā)展相當(dāng)迅速。孫立國[14]等在對大鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ST-Ⅲ可有效降低大鼠中的血清膽固醇水平，高劑量的ST-Ⅲ還可以顯著提高大鼠血清的高密度脂蛋白。潘道東等人[15]通過體外篩選到一株降膽固醇的乳酸乳球菌亞種，將其發(fā)酵酸奶并喂養(yǎng)高脂模型大鼠，實驗組大鼠血清中TC、TG含量較對照組明顯下降。王巍等人[16]研究了經(jīng)體外實驗篩選出的降膽固醇

30、乳酸菌對肉雞各組織膽固醇含量的影響，結(jié)果顯示肉雞血清、胸肌組織和腿肌組織膽固醇含量發(fā)生了顯著變化，但肝臟組織中膽固醇含量無顯著差異。</p><p>　　有關(guān)乳酸菌降膽固醇的研究主要集中于益生乳酸菌屬，如嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、兩歧雙歧桿菌等[17,18]。而乳酸菌大量存在于酸乳及發(fā)酵制品中，許多的研究主要是從一些傳統(tǒng)發(fā)酵食品（如酸奶、泡菜、干酪等）中篩選得到實驗菌株的[3,19-20]，另外哺乳動物

31、腸道中的乳酸菌經(jīng)過了胃腸環(huán)境的考驗，表現(xiàn)出一定的耐酸和耐膽鹽性，因此也可以從哺乳動物胃腸道中分離菌株[21]。</p><p>　　2.3 降膽固醇乳酸菌的應(yīng)用</p><p>　　自上世紀八十年代以來，國內(nèi)外研究人員一直關(guān)注降膽固醇食品的開發(fā)，取得了不少成就。目前歐美和日本市場上已經(jīng)有類似的具有降低血清膽固醇的益生乳酸菌制品[2]。在國內(nèi)，尹忠平等人[3]以鮮雞蛋為主要原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵

32、作用加工凝固型降膽固醇發(fā)酵全蛋飲料，他們通過對嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、兩岐雙岐桿菌及其復(fù)合菌種的降膽固醇能力進行測定，選擇嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌作為復(fù)合發(fā)酵菌種，對發(fā)酵基質(zhì)配方和發(fā)酵條件進行優(yōu)化后，膽固醇降解率可達36.03%，且全蛋飲料感官質(zhì)量較好。呂兵等[22]在質(zhì)量分數(shù)為 11%脫脂乳培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)為 7%的啤酒，發(fā)現(xiàn)能顯著提高嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸速率及活菌總數(shù)。該菌株耐鹽和耐膽酸鹽能力分別達到 6.0% 和

33、1.5%，同化膽固醇達 80%，再用 3%該嗜酸乳桿菌+ 0.5%唾液鏈球菌嗜熱亞種+ 0.5% 德氏乳桿菌保加利亞亞種為復(fù)合發(fā)酵劑，按常規(guī)工藝生產(chǎn)酸乳，產(chǎn)品中嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)達到109 cfu/mL 以上，5d 后其活菌數(shù)仍有6×108 cfu/mL，且酸乳產(chǎn)品風(fēng)味良好。</p><p>　　3 乳酸菌降膽固醇的作用機理</p><p>　　在過去20多年，國內(nèi)外研究者對乳酸

34、菌降低膽固醇的作用機理進行了廣泛的科學(xué)研究。目前主要有以下三種觀點。</p><p><b>　　3.1 吸收理論</b></p><p>　　在厭氧條件下，乳酸菌在含有膽鹽的高膽固醇培養(yǎng)基上生長時，菌體細胞會吸收介質(zhì)中的膽固醇，從而降低膽固醇含量。Gilliland 等[8]從豬腸道中分離到高效降膽固醇嗜酸乳桿菌，并對其進行了體內(nèi)和體外研究。他們以類胸膜炎體代替膽固

35、醇加入到含有不同膽鹽的培養(yǎng)基中，接種后厭氧培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中膽固醇含量明顯降低，破碎菌體細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)膽固醇含量顯著增加，因此他們認為菌體對膽固醇有吸收作用。董改香等[23]通過膽固醇吸收動力曲線和超聲波抗性實驗對一株從酸馬奶中分離所得的乳酸菌進行降膽固醇機理研究，發(fā)現(xiàn)在加有膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的乳酸菌對抗超聲波的抵抗能力增強，其認為是菌體把膽固醇吸收進入細胞體內(nèi)，改變了細胞膜的韌性所致。</p><p>　

36、　3.2 共沉淀理論[2,18]</p><p>　　乳酸菌在生長過程中降解介質(zhì)中的結(jié)合膽鹽釋放出游離膽酸，在PH≤6.0 時，后者的溶解度比結(jié)合膽鹽的溶解度小，與膽固醇形成復(fù)合物共沉淀下來，從而達到降低介質(zhì)中膽固醇含量的目的。</p><p>　　這種共沉淀去除膽固醇效果可能的機理有兩個：膽固醇的溶解度取決于膽鹽的溶解度，膽鹽轉(zhuǎn)化成游離膽酸后，溶液吸附到膳食成分和菌體上，由于溶解度下降致

37、使膽固醇共沉淀析出；在體內(nèi)，游離膽酸不被人體重新吸收而隨糞便排出，減少了其在腸肝的循環(huán)次數(shù)，從而增加了膽酸的生物合成，由于膽固醇是合成膽酸的前體，部分膽固醇就必然轉(zhuǎn)化成膽酸來補充被排出體外而損失的膽酸，加速了膽固醇的代謝，進而引起膽固醇濃度的降低。</p><p><b>　　3.3 其他理論</b></p><p>　　乳酸菌降低膽固醇的作用受多種因素的影響，其作用

38、方式因采用的菌種(株)和測試對象有很大的差別。對于嗜酸乳桿菌和其他乳酸菌(如雙歧桿菌)降低膽固醇的作用，部分研究人員傾向于菌體吸收和共沉淀聯(lián)合作用的觀點，并且在不同條件下乳酸菌會表現(xiàn)出以某一種作用方式為主的能力。有人[24]研究了四株從內(nèi)蒙古稀奶油中分離的乳酸菌的降膽固醇能力，結(jié)果顯示四株試菌株均有共沉淀和吸收作用，其中干酪乳酸菌以共沉淀為主，屎腸球菌以吸收作用最為顯著。記旭等人[25]的研究也發(fā)現(xiàn)干酪乳酸菌對膽固醇的降解是吸收和共沉淀

39、共同作用的結(jié)果，且共沉淀作用大于吸收作用。</p><p>　　另外，對雙歧桿菌的研究還發(fā)現(xiàn)：雙歧桿菌通過抑制人體內(nèi)活化的T 細胞，可以控制新形成的低密度脂蛋白接受器，有助于降低血清膽固醇含量。St-Onge 等人[26]還認為乳酸菌在結(jié)腸發(fā)酵未吸收的碳水化合物時，產(chǎn)生了包括丙酸在內(nèi)的短鏈脂肪酸，這些產(chǎn)物可抑制膽固醇合成的主要限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶而降低膽固醇。</p>

40、<p>　　4 存在的問題及展望</p><p>　　雖然大量的實驗證明乳酸菌能夠降低膽固醇，但是在一些方面尚存在一些問題，有待于進一步研究。主要表現(xiàn)有：① 由于體內(nèi)被分解的共軛膽鹽無法重新進入肝臟循環(huán)，只能進入大腸，在大腸內(nèi)可能被微生物降解成為具有致癌性的次生膽鹽，所以降膽固醇乳酸菌在被人體食用后的安全問題需加以考慮[27]；② 不同菌株降膽固醇的效果不一，同一種菌株，不同實驗的人群食用后效果也會千

41、差萬別；③ 研究人員總是希望篩選到具有高效降膽固醇的菌株，但是經(jīng)體外試驗后并不能確保其在體內(nèi)仍有相同的效果[6]。目前，各國研究人員正在積極研究解決。</p><p>　　隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、人們生活水平的提高和對健康的追求，乳制品加工技術(shù)必將發(fā)生質(zhì)的飛躍；采用先進的乳制品加工工藝，開發(fā)新型乳制品，調(diào)整乳制品產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，也必將是乳品工業(yè)的發(fā)展趨勢所在。在發(fā)酵乳制品方面，對于具有多種風(fēng)味特征和良好保健功能的發(fā)酵乳制品

42、，人們的需求量會不斷增大；各類健康及具有預(yù)防或有助于病后康復(fù)等調(diào)節(jié)身體功能的各種功能性乳制品，將得到較快發(fā)展并占據(jù)越來越大的市場份額。目前，我國乳制品還是以奶粉為主，發(fā)酵乳制品如酸奶所占的比例較低，而且國內(nèi)益生菌發(fā)酵乳制品采用的菌種和發(fā)酵劑幾乎完全被國外企業(yè)和產(chǎn)品壟斷，真正具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、適合中國人群生理特征的益生菌產(chǎn)品幾乎為零，這將制約我國益生乳酸菌產(chǎn)業(yè)和發(fā)酵乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[28]。以國內(nèi)市場來看，酸奶和各種發(fā)酵乳飲料等將是未來

43、我國乳品工業(yè)中增幅最大的產(chǎn)品種類，其中具特定生理調(diào)節(jié)作用的功能性發(fā)酵乳制品將是重要發(fā)展趨勢。</p><p>　　國外的酸奶市場十分注重產(chǎn)品更新（尤其是保健型酸奶），類似降膽固醇的益生乳酸菌制品目前已經(jīng)投入市場[2,29]，而國內(nèi)還停留在實驗階段。據(jù)2007年的《中國心血管病報告》估計我國現(xiàn)有高血壓患者2億，腦卒中700萬，心肌梗死200萬，心力衰竭420萬；每年心臟性猝死54萬，為全球之首；每10個成年人中就有

44、2人是心血管病，每10.5秒就有1人死于心血管病。因此，開發(fā)新型降膽固醇發(fā)酵乳制品，具有廣闊的市場前景。開發(fā)新型降膽固醇發(fā)酵乳制品可改善我國乳制品種類比較單一的現(xiàn)狀，而且可以帶動農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展，增加農(nóng)業(yè)收入，從長遠來看，這也有利于提高人們的健康水平。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 吳肖,劉通訊.乳與膽固醇[J]. 中國乳品工業(yè)

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60、;/p><p>　　新型降膽固醇酸奶的研制</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　0 引言1</b></p><p>　　1 實驗材料與方法2</p><p>　　1.1 實驗材料2</p><p>　　1.1.1 菌

61、株2</p><p>　　1.1.2 原料2</p><p>　　1.1.3 試劑2</p><p>　　1.1.4 培養(yǎng)基2</p><p>　　1.1.5 儀器與設(shè)備3</p><p><b>　　1.2 方法3</b></p><p>　　1.2.1 菌種

62、活化3</p><p>　　1.2.2 發(fā)酵劑的制備3</p><p>　　1.2.3 酸奶的制作4</p><p>　　1.2.4 感官評定4</p><p>　　1.2.5 酸度測定5</p><p>　　1.2.6 單因素試驗5</p><p>　　1.2.7 正交試驗優(yōu)化酸奶

63、發(fā)酵工藝6</p><p>　　1.2.8 酸奶膽固醇降解率的測定6</p><p><b>　　2 結(jié)果8</b></p><p>　　2.1 混菌比例對酸奶品質(zhì)的影響8</p><p>　　2.2 接種量對酸奶品質(zhì)的影響8</p><p>　　2.3 發(fā)酵時間對酸奶品質(zhì)的影響8&l

64、t;/p><p>　　2.4 發(fā)酵溫度對酸奶品質(zhì)的影響9</p><p>　　2.5 正交試驗9</p><p>　　2.6 酸奶膽固醇降解率測定11</p><p>　　2.6.1 膽固醇標準曲線的繪制11</p><p>　　2.6.2 優(yōu)化前后酸奶膽固醇降解率的測定11</p><p&g

65、t;<b>　　3 討論12</b></p><p>　　3.1發(fā)酵劑的配方12</p><p>　　3.2 發(fā)酵劑的選擇及保存13</p><p>　　3.3 酸奶的感官評定13</p><p>　　3.4 乳酸菌降膽固醇的作用機理13</p><p>　　3.5 酸奶膽固醇降解率1

66、3</p><p><b>　　4 結(jié)論14</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻14</b></p><p>　　摘 要：本實驗以分離自新疆酸馬奶、具有高效降膽固醇活性的發(fā)酵乳桿菌SM-7和另一株實驗室保存菌株乳酸乳球菌亞種LQ-12發(fā)酵制

67、備酸奶，通過單因素試驗比較混菌比例、接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對酸奶感官品質(zhì)的影響，再通過正交試驗和感官評定確定酸奶最佳發(fā)酵條件為菌種配比1:1（發(fā)酵乳桿菌：乳酸乳球菌），接種量為6%，發(fā)酵溫度為42°C，發(fā)酵時間為8h。利用該條件發(fā)酵的酸奶，組織狀態(tài)比較粘稠，乳清析出少，香氣較好，酸甜適宜，且膽固醇降解率達27.51%。</p><p>　　關(guān)鍵詞：發(fā)酵乳桿菌SM-7；乳酸乳球菌亞種LQ-12；酸奶；

68、降膽固醇；感官品質(zhì)</p><p>　　Abstract: The lactic acid bacteria strain SM-7 was screened from koumiss in Xing Jiang Province and was identified as Lactobacillus fermentum. The animal experiment found that Lactobacillu

69、s fermentum SM-7 strain had a significant effect on cholesterol-reducing function in mice with hyperlipemia. In this study, Lactobacillus fermentum SM-7 and Lactococus.lactis subsp.lactis LQ-12 were used to ferment yogur

70、t. The effects of strain ratio, inoculum amount, fermentation time and fermentation temperat</p><p>　　Keywords: Lactobacillus fermentum SM-7; Lactococus.lactis subsp.lactis LQ-12; yogurt; Cholesterol-lowerin

71、g; sensory quality.</p><p><b>　　0 引言</b></p><p>　　膽固醇在體內(nèi)具有重要的生理功能，是人體不可缺少的物質(zhì)。然而，高水平的血清總膽固醇被認為是導(dǎo)致冠心病和動脈粥樣硬化的重要因素，降低血清膽固醇水平可以減少缺血性心臟?。↖HD）和動脈粥樣硬化的發(fā)病率和死亡率[1]。如以正常膽固醇水平為基礎(chǔ)，血清膽固醇每升高1 mmol

72、，機體患冠心病的危險大約增加35%，冠心病死亡的危險增加45%；血清膽固醇每減少1%，患冠心病的危險性就降低2%~3%[2]。隨著人們生活水平的提高，飲食不規(guī)律、飲食過量的情況時有發(fā)生，膽固醇的攝入也就很容易超標。據(jù)2007年的《中國心血管病報告》估計：我國現(xiàn)有高血壓患者2億，腦卒中700萬，心肌梗死200萬，心力衰竭420萬；每年心臟性猝死54萬，為全球之首；每10個成年人中就有兩人是心血管病，每10.5秒就有一人死于心血管病?？梢?，

73、控制人體血清膽固醇水平十分迫切。</p><p>　　1974年，Mann和Spoerry[3 ]發(fā)現(xiàn)非洲Masai部落大量飲用由乳酸菌發(fā)酵制得的乳制品，其體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低；三年后，他們又調(diào)查了經(jīng)常消費酸奶和發(fā)酵乳制品的美國人，發(fā)現(xiàn)這類人群體內(nèi)血清膽固醇的含量也很低。這一發(fā)現(xiàn)引起了國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域研究人員的廣泛關(guān)注。從此，有許多動物和人體試驗致力于研究日常發(fā)酵乳制品對血清膽固

74、醇的作用，此外還有許多體內(nèi)、體外試驗致力于研究乳酸菌降膽固醇作用的相關(guān)機理[4,5]。</p><p>　　在醫(yī)學(xué)上，血清膽固醇常通過藥物控制，但隨著乳酸菌降膽固醇作用研究的深入，通過食療法控制膽固醇越來越受到青睞。目前歐美和日本市場上已經(jīng)有類似的具有降膽固醇功能的益生乳酸菌制品[6]，但國內(nèi)仍處于實驗室階段。另一方面，針對乳制品這一塊，我國仍是以奶粉生產(chǎn)為主，而發(fā)酵乳制品所占比例較低、品種單一，尤其是益生菌發(fā)酵

75、乳制品的生產(chǎn)，很大程度上需依賴國外菌種和發(fā)酵劑，這將嚴重制約我國發(fā)酵乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。</p><p>　　酸馬奶是以新鮮馬奶為原料，利用天然發(fā)酵劑和傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵而成的一種古老的乳酸菌醫(yī)療保健品，其除了具有除濕化瘀、健脾開胃的保健功效之外，還能治療心血管系統(tǒng)疾病，其中含有的乳酸菌被認為是降膽固醇功能的有效成分之一 [7]。本實驗室從新疆牧民家庭制作的傳統(tǒng)酸馬奶中分離出一些乳酸菌菌株，經(jīng)過益生活性測定及降膽固醇

76、實驗已篩選得到一株具有高效降膽固醇的發(fā)酵乳桿菌SM-7（Lactobacillus fermentum SM-7），動物實驗發(fā)現(xiàn)其對實驗性高脂血癥小鼠血清膽固醇有顯著的降低作用[8]。</p><p>　　本實驗運用實驗室保存的發(fā)酵乳桿菌SM-7與另一株乳酸乳球菌亞種LQ-12(Lactococus.lactis subsp.lactis LQ-12)[9]發(fā)酵制備酸奶（這兩株菌均經(jīng)過動物安全試驗，證明是安全的）

77、，研究混菌比例、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間四個因素對酸奶品質(zhì)的影響，并通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，開發(fā)出一種具有降膽固醇功能的新型酸奶。</p><p><b>　　1 實驗材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 實驗材料</b></p><p><b>　　1.1.1 菌株</b>&l

78、t;/p><p>　　發(fā)酵乳桿菌SM-7（Lactobacillus fermentum SM-7）、乳酸乳球菌亞種LQ-12 (Lactococus.lactis subsp.lactis LQ-12)為實驗室已篩選并保存的菌種（保存于-41°C冰箱中）。</p><p><b>　　1.1.2 原料</b></p><p>　　完達山

79、脫脂奶粉（市售）：400 g /16袋 </p><p><b>　　白糖（市售）</b></p><p><b>　　1.1.3 試劑</b></p><p>　　0.1mol/L 氫氧化鈉標準溶液：由實驗室制備。</p><p>　　酚酞指示劑：稱取0.5 g 酚酞溶于75 mL 體積分數(shù)為95

80、 %的乙醇中，并加入 20 mL 水，然后滴加氫氧化鈉標準溶液至微粉色，再加入水定容至 100 mL。</p><p>　　膽固醇標準溶液（1mg/mL）：準確稱取膽固醇（分析純）100 mg， 加冰乙酸溶解并定容至100 mL。</p><p>　　鄰苯二甲醛試劑（OPA）：準確稱取鄰苯二甲醛（分析純）10 mg，加冰乙酸溶解并定容至100 mL，置于棕色瓶中避光保存。</p>

81、;<p><b>　　冰乙酸(分析純)</b></p><p><b>　　濃硫酸(分析純)</b></p><p>　　甲醇氯仿混合溶液（甲醇：氯仿=2:1）</p><p><b>　　1.1.4 培養(yǎng)基</b></p><p>　　MRS 培養(yǎng)基[10]&l

82、t;/p><p><b>　　葡萄糖 20 g</b></p><p><b>　　蛋白胨 10 g</b></p><p><b>　　酵母浸膏 5 g</b></p><p><b>　　小牛浸膏 5 g</b></p><p>&

83、lt;b>　　乙酸鈉 5 g</b></p><p>　　檸檬酸銨 2.0 g</p><p>　　K2HPO4·2H2O 2.0 g</p><p>　　MnSO4·H2O 0.25 g</p><p>　　MgSO4·7H2O 0.6 g</p><p>　　吐

84、溫-80 1 mL</p><p>　　若配成固體培養(yǎng)基，還需加入15‰ 的瓊脂</p><p>　　H2O 1000 mL</p><p>　　高膽固醇培養(yǎng)基（MRS-CHOL）[11,12]</p><p><b>　　膽固醇 0.1 g</b></p><p><b>　　豬膽鹽

85、0.2 g</b></p><p>　　吐溫-80 1 mL</p><p><b>　　冰乙酸5 mL</b></p><p>　　將以上試劑配成膽固醇母液，加熱溶解后加入至1000 mL MRS液體培養(yǎng)基中，用超聲波細胞粉碎機500 W 振蕩乳化20 min，調(diào)節(jié)pH 值為7.0，最終配成濃度為100 μg/mL 的高膽固醇培養(yǎng)

86、基。</p><p>　　以上所用試劑均為分析純，所配置的培養(yǎng)基均在115°C條件下滅菌20 min后備用。</p><p>　　1.1.5 儀器與設(shè)備</p><p>　　LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。</p><p>　　JY92-IIN超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司。</p&

87、gt;<p>　　KD723可見分光光度計。</p><p>　　H2050R-2離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司。</p><p>　　冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。</p><p>　　HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠。</p><p>　　DKS-26電熱恒溫水浴鍋：寧波江南儀器廠。</p>

88、;<p>　　DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司。</p><p>　　JB090312-02凈化工作臺：蘇州華科凈化設(shè)備有限公司。</p><p><b>　　分析天平</b></p><p><b>　　電磁爐：美的。</b></p><p><b>　　冰箱

89、：海爾。</b></p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 菌種活化</p><p>　?、?打開超凈工作臺紫外燈，約20 min后關(guān)閉紫外燈，開啟通風(fēng)。用酒精棉擦拭雙手后，趁熱將滅菌后的MRS 固體培養(yǎng)基倒平板，每皿倒15～20 mL。在等待固體培養(yǎng)基凝固的時候，取出保藏于-41°

90、C冰箱中的菌株（發(fā)酵乳桿菌SM-7和乳酸乳球菌亞種LQ-12），放于室溫解凍。</p><p>　?、?待固體培養(yǎng)基凝固完全，將發(fā)酵乳桿菌SM-7和乳酸乳球菌亞種LQ-12分別在MRS平板上劃線分離，做好標記后，將平板放在37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。</p><p>　?、?培養(yǎng)40～48h后，平板上即可看見單菌落，挑取單菌落至滅菌后的MRS 液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至

91、渾濁；接著吸取一定量（1～2%）的菌液轉(zhuǎn)接至滅菌后的MRS 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至渾濁，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次進行菌種活化。</p><p>　　1.2.2 發(fā)酵劑的制備</p><p>　?、?配制：按照奶粉包裝上的配方制備脫脂復(fù)原乳（一袋奶粉，加入180mL 熱水?dāng)嚢枞芙?，最終體積為200mL），再按5g/100mL脫脂復(fù)原乳的比例加入白糖制成發(fā)酵底物。</p><p>

92、;　?、?分裝：將發(fā)酵底物趁熱分裝至已滅菌的的容器中，灌裝好后立即封口。</p><p>　　⑶ 熱處理：將脫脂復(fù)原乳置于85～90°C水浴鍋中保持15～30 min進行滅菌[13]。</p><p>　　⑷ 冷卻：滅菌結(jié)束后，將脫脂復(fù)原乳立即冷卻至發(fā)酵溫度（40～45°C），避免嗜熱細菌生長造成二次污染。</p><p>　?、?接種發(fā)酵：將活

93、化的兩種菌種由MRS 液體培養(yǎng)基中按體積分數(shù)5%的接種量轉(zhuǎn)接至滅菌且冷卻后的脫脂復(fù)原乳中，37°C發(fā)酵至凝乳。轉(zhuǎn)接一次制成母發(fā)酵劑，連續(xù)轉(zhuǎn)接兩次制成生產(chǎn)發(fā)酵劑[14]。</p><p>　?、?母發(fā)酵劑：將活化的菌種從MRS 液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接至滅菌后的脫脂復(fù)原乳中發(fā)酵凝乳所得。</p><p>　?、?生產(chǎn)發(fā)酵劑：將母發(fā)酵劑轉(zhuǎn)接至滅菌后的脫脂復(fù)原乳中發(fā)酵凝乳所得。</p&g

94、t;<p>　　⑻ 單一發(fā)酵劑：只含有一種菌的發(fā)酵劑。</p><p>　?、?復(fù)合發(fā)酵劑：含有兩種或兩種以上菌的發(fā)酵劑，本實驗中提到的是含有發(fā)酵乳桿菌SM-7和乳酸乳球菌亞種LQ-12兩種菌的發(fā)酵劑。</p><p>　　1.2.3 酸奶的制作</p><p>　?、拧?同1.2.2的⑴～⑷</p><p>　?、?接種發(fā)酵

95、：將生產(chǎn)發(fā)酵劑（包括單一發(fā)酵劑和復(fù)合發(fā)酵劑）按一定的接種量接種至滅菌且冷卻后的脫脂復(fù)原乳中，在一定溫度下發(fā)酵至凝乳，取出后放置于4°C冰箱中進行后熟。</p><p>　　1.2.4 感官評定</p><p>　　酸奶的后熟時間一般為12～24 h左右，后熟完成后即可品嘗。將酸奶樣品分別倒入試吃杯中，選定5～10個評定人員進行感官評定。注意每個感官評定人員在品嘗前，需用溫水漱口，

96、避免樣品間口感的影響。評定人員參照評定標準進行打分（表1），最后將評分表進行匯總得出結(jié)果。</p><p>　　表1 感官評定標準[15]</p><p>　　Table 1.Sensory evaluation standards[15]</p><p>　　1.2.5 酸度測定</p><p>　　按照GB 5413.34-2010規(guī)定的

97、方法進行酸奶酸度的測定：稱取10g（精確到0.001g）已混勻的試樣，置于150 mL 錐形瓶中，加20 mL 新煮沸冷卻至室溫的水，混勻，加入2.0 mL</p><p>　　酚酞指示劑，混勻后用0.1mol/L 氫氧化鈉標準溶液滴定至微紅色，并在30 s 內(nèi)不褪色，記錄消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液毫升數(shù)，代入下面公式進行計算。</p><p><b>　　式中：</b&g

98、t;</p><p>　　X 試樣的酸度，單位為度 (ºT)；</p><p>　　c 氫氧化鈉標準溶液的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）</p><p>　　V 滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積，單位為毫升（mL）</p><p>　　m 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）</p><p>　　0.1 酸度理

99、論定義氫氧化鈉的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）</p><p>　　在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。</p><p>　　1.2.6 單因素試驗</p><p><b>　?、?混菌比例</b></p><p>　　按表2所示比例制備發(fā)酵劑。</p>&l

100、t;p>　　表2 發(fā)酵劑菌種配比</p><p>　　Table 2.The strain ratio of starter culture</p><p>　　將以上四種發(fā)酵劑按5%的接種量接種至滅菌且冷卻后的脫脂復(fù)原乳中，在37°C發(fā)酵10 h，取出后放置于4°C冰箱中進行后熟，然后通過感官評定和酸度測定，確定合適的發(fā)酵劑。</p><p&

101、gt;<b>　　⑵ 接種量</b></p><p>　　將由⑴確定的合適發(fā)酵劑按體積分數(shù)3%、4%、5%、6%、7%的量接種至滅菌且冷卻后的脫脂復(fù)原乳中，在37°C發(fā)酵10 h，取出后放置于4°C冰箱中進行后熟，然后進行感官評定和酸度測定，確定合適的接種量。</p><p><b>　?、?發(fā)酵時間</b></p>

102、;<p>　　將由⑴確定的發(fā)酵劑按⑵確定的接種量接種至滅菌且冷卻后的脫脂復(fù)原乳中，在37°C分別發(fā)酵6h、8h、10h、12h，取出后放置于4°C冰箱中進行后熟，然后進行感官評定和酸度測定，確定較佳的發(fā)酵時間。</p><p><b>　?、?發(fā)酵溫度</b></p><p>　　將由⑴確定的發(fā)酵劑按⑵確定的接種量接種至滅菌且冷卻后的

103、脫脂復(fù)原乳中，分別在37°C、40°C、43°C發(fā)酵至由⑶確定的最佳發(fā)酵時間，取出后放置于4°C冰箱中進行后熟，然后通過感官評定和酸度測定，確定較佳的發(fā)酵溫度。</p><p>　　1.2.7 正交試驗優(yōu)化酸奶發(fā)酵工藝</p><p>　　根據(jù)單因素試驗確定制備降膽固醇酸奶的最佳菌種配比、接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度。在此基礎(chǔ)上，選擇各因素的合適水平，

104、設(shè)計正交試驗表L9(34)，接著根據(jù)正交表進行試驗，然后通過感官評定對9組試驗進行評分，匯總數(shù)據(jù)后分析正交表，最終結(jié)合實際情況，確定酸奶最佳發(fā)酵工藝并進行驗證實驗。</p><p>　　1.2.8 酸奶膽固醇降解率的測定</p><p>　　吸取1.2.4（1）確定的最佳發(fā)酵劑5mL 接種至100 mL 高膽固醇培養(yǎng)基（MRS-CHOL）中，37°C靜置培養(yǎng)24 h后，6000

105、r/min離心5 min，上清液傾倒至平皿中，用保鮮膜包好后放于-41°C冰箱中凍結(jié)，凍結(jié)時間為2～3天。然后用冷凍干燥機凍干用于測定膽固醇含量（注意在凍干前，需要將保鮮膜表面戳破；凍干時間至少為兩天兩夜）。計算膽固醇降解率時，以未接種的高膽固醇培養(yǎng)基（MRS-CHOL）作為對照。</p><p>　　將按1.2.5正交試驗確定的最佳發(fā)酵工藝制備的酸奶做相同處理，以未接種的高膽固醇培養(yǎng)基（MRS-CHO

106、L）作為對照，測定酸奶的膽固醇降解率。</p><p>　　上清液凍干粉的膽固醇含量測定[16,17]</p><p><b>　?、?實驗原理</b></p><p>　　凍干樣品中膽固醇經(jīng)甲醇氯仿有機溶液的抽提，與鄰苯二甲醛試劑（OPA）發(fā)生羥醛反應(yīng)（鄰苯二甲醛有兩個醛基（-CHO），膽固醇的C3位上有一個羥基，二者在濃硫酸作用下產(chǎn)生紫紅色

107、物質(zhì)，在波長550nm 處有最大吸收值）。</p><p>　?、?繪制膽固醇標準曲線</p><p>　　按表3進行膽固醇標準曲線的繪制。</p><p>　　表3 OPA法測定膽固醇的標準曲線繪制方法</p><p>　　Table 3.Standard curve of cholesterol measured by OPA</

108、p><p>　　溶液配制時邊加濃硫酸邊振蕩，充分混勻，室溫靜置10min，于550nm處測定吸光值。</p><p>　?、?測定凍干樣品中膽固醇含量</p><p>　　① 稱取100mg凍干樣品（接種優(yōu)化發(fā)酵工藝制備的酸奶的高膽固醇培養(yǎng)基、接種原來發(fā)酵劑的高膽固醇培養(yǎng)基、未接種的高膽固醇培養(yǎng)基）置于小燒杯中，加2mL 甲醇氯仿溶液攪拌溶解，將溶液過濾后留待備用；&l

109、t;/p><p>　　② 取100μL濾液、100μL甲醇氯仿溶液置于標有“實驗”和“空白”字樣的小試管中，加入300μL冰乙酸，1.5mL鄰苯二甲醛試劑，1.0 mL 濃硫酸，充分振蕩，混勻，室溫靜置10min，以空白管調(diào)零，于550nm處測定樣品的吸光值。</p><p>　　③ 每個樣品做三次平行實驗，測定膽固醇含量，然后取平均值。</p><p>　　樣品中膽固

110、醇含量按以下公式計算：</p><p>　　W（μg/100mg）=</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　C---通過吸光值從標準曲線上讀出的膽固醇含量（μg/100mL）</p><p>　　20---從2 mL樣液中吸取100μL濾液(mL)</p><p>　　m

111、---樣品的質(zhì)量（mg）</p><p>　　膽固醇降解率按以下公式計算：</p><p>　　膽固醇降解率（%）=</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　W1 ---未接種的高膽固醇培養(yǎng)基膽固醇含量（μg/100mg）</p><p>　　W2---接種1.2.4（1）

112、確定的最佳發(fā)酵劑的高膽固醇培養(yǎng)基膽固醇含量（μg/100mg）</p><p>　　W3---接種1.2.5正交試驗確定的最佳發(fā)酵工藝制備的酸奶的高膽固醇培養(yǎng)基膽固醇含量（μg/100mg）</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 混菌比例對酸奶品質(zhì)的影響</p><p>　　按照表2制