桑葉中不同提取物抑菌作用的研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p><b>　　食品科學與工程</b></p><p>　　桑葉中不同提取物抑菌作用的研究</p><p><b>　　摘 要</b>&l

2、t;/p><p>　　本論文研究了桑葉（Mulberry）對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌效果。實驗從觀察供試菌種的生長情況、抑菌圈直徑長度、桑葉提取物最低抑菌濃度（MIC）這幾個方面來進行研究。通過濾紙片擴散法觀察5種提取物（濃縮液、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、剩余相）對金黃色葡萄球菌（Staphy

3、lococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌效果，并測定其抑菌圈直徑。實驗結果表明：桑葉提取液對供試金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）都有明顯的抑菌效果，抑菌強度為：正丁醇相＞乙酸乙酯相＞濃縮液＞石油醚相＞剩余相。并且，用正丁醇相對其三種供試菌種進行最低抑菌濃度（

4、MIC）的測定，分別為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）0.5×10-2（g浸膏/mL），大腸桿菌（E.coli）1.0×10-2（g</p><p>　　本文又對桑葉各提取物中黃酮類化合物進行了含量測定，顯示桑葉提取物中黃酮類化合物含量與提取物對供試菌種的抑制作用存在著一定正相關性。桑葉提取物中所含黃酮類化合物越高，抑菌效果越好。</p><p

5、>　　關鍵詞：桑葉；黃酮；抑菌；提取液；MIC；分級萃取</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In this study,we analyzed the inhibitory effect of the Mulberry leaves on Staphylococcus aureus, E.coli and Bacillus

6、 subtilis. The experiment researched the growth, length of inhibition zone diameter and MIC.We observed five extract (concentrated liquid, petroleum ether, ethyl acetate, butanol phase, and the remaining phase) which eff

7、ected on the inhibitory of Staphylococcus aureus, E.coli and Bacillus subtilis by filter paper diffusion method, and recorded results. The results showed that: mulb</p><p>　　Flavonoids content in different f

8、ractions were determined .The results showed that the relationship between flavonoid content and antibacterial avtivity was a certain positive correlation. </p><p>　　Keywords: mulberry; flavonoids; antibacte

9、rial; extract; MIC; grade extraction</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料2</b></p><p>　　2.1材料、試劑與儀器2</p

10、><p><b>　　2.2供試菌種2</b></p><p><b>　　2.3培養(yǎng)基2</b></p><p>　　2.4主要實驗設備2</p><p><b>　　3 實驗方法3</b></p><p>　　3.1原料的處理3</p&g

11、t;<p>　　3.2培養(yǎng)基的配制3</p><p>　　3.3桑葉提取液的制備3</p><p>　　3.4供試菌種的配制3</p><p>　　3.5菌懸液的制備3</p><p>　　3.6濾紙片擴散法4</p><p>　　3.7標準曲線的繪制4</p><p>

12、;　　3.8桑葉提取物中黃酮含量的測定5</p><p>　　3.9桑葉提取液最低抑菌濃度（MIC）的測定5</p><p><b>　　4 結果與分析5</b></p><p>　　4.1桑葉乙醇提取液對供試微生物的抑制作用5</p><p>　　4.2桑葉提取液對供試微生物的抑制效果7</p>

13、<p>　　4.2.1桑葉提取的抑菌圈直徑大小7</p><p>　　4.2.2標準曲線8</p><p>　　4.2.3桑葉提取液中黃酮類化合物含量的測定8</p><p>　　4.3桑葉正丁醇提取液最低抑菌濃度（MIC）8</p><p><b>　　5 總結8</b></p>&

14、lt;p><b>　　參考文獻10</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p>　　附錄1 文獻綜述錯誤!未定義書簽。</p><p>　　附錄2 外文翻譯錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 前言</b></p><p&g

15、t;　　桑葉（Mulberry）原產于我國和朝鮮。如今在全球大約有16種，現分布于北溫帶、亞洲熱帶和非洲熱帶及美洲地區(qū)。我國就約有11種，分布于全國大部分地區(qū)，以江蘇、浙江等南方養(yǎng)蠶地區(qū)產量較大[1]。我國是世界上最大的桑樹種植國，桑樹在我國已有4000多年的歷史，主要有白桑（Morus alba）、華桑(M.cathayana)、山桑(M.diabolica)、蒙桑(M.Mongolic)等10多個品種。[2]</p>

16、<p>　　桑葉是桑科植物桑的干燥葉，又有別名為家桑、荊桑、桑椹樹、黃桑等，其品質優(yōu)越，資源豐富，一般在初霜后采收。桑葉可以用來養(yǎng)蠶，也是防沙固沙的植物，同時也可以用于藥理，在我國是一味常見的中藥藥材，中醫(yī)又稱之為“鐵扇子”[3]。桑葉自古以來就被人認為有疏散風熱，清肺潤燥，平抑肝陽，清肝明目，涼血止血的功效[4-5]。經現代的藥理理論和臨床試驗證明，桑葉對降血糖、降血脂、降膽固醇有明顯療效；還可解痙、抗?jié)僛6]、鎮(zhèn)咳[7]

17、、清楚自由基，抗衰老[8]、抗病毒、抗炎[9]、抗菌、抗凝血[10]，并對絲蟲病有預防作用[11]，改善消化系統、心血管系統[12]的功能。</p><p>　　桑葉具有抑菌作用，主要是由于酚類物質破壞了細胞壁及細胞膜的完整性，導致微生物細胞釋放胞內成分，引起膜的電子傳遞、營養(yǎng)吸收、核苷酸合成及ATP活性等功能障礙，從而抑制微生物的生長。桑葉中含有多種酚類化合物，主要是黃酮類化合物，如槲皮素、蕓香苷等[13]。桑

18、葉水抽提液濃度（31mg/mL）體外有抗鉤端螺旋體作用，桑葉中的植物防御素有抗微生物作用。</p><p>　　桑葉除了在藥理上具有應用價值外，還在化妝品方面作為原料。近年來的研究證明，桑葉有良好的護膚美容作用[14]，特別是對臉部的痤瘡、褐色斑都有比較好的療效。對改善和調節(jié)皮膚組織的新陳代謝，特別是抑制色素沉著的發(fā)生和發(fā)展均具有良好的作用。此外，用桑葉沐浴也是很好的美容浴方。它性涼滋潤，護膚而不脫脂，對皮膚粗糙

19、的人是絕佳的選擇。</p><p>　　用桑葉混合而成的飼料具有很多優(yōu)點，并在畜牧業(yè)上的應用日趨廣泛。給雞喂桑葉飼料可改善其肉質、香味、和口感[15]。此外。嚴冰等[16]研究表明反芻動物對桑葉有很高的消化率。</p><p>　　因此桑葉是一類具有較高開發(fā)價值的物質，它既可防治疫病，又能促進生長，還可節(jié)約飼料，提高效益，可謂是一舉數得。根據桑葉的抑菌性質，本論文對其從觀察供試菌種的生長情

20、況、抑菌圈直徑長度、桑葉正丁醇提取物最低抑菌濃度（MIC）以及提取液中黃酮含量對抑菌作用的正相關性這幾個方面進行了研究分析。</p><p>　　2 實驗主要儀器與材料</p><p><b>　　2.1試劑與儀器</b></p><p>　　桑葉（Mulberry）(購于藥房中)；分液漏斗、酒精燈、電磁爐、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、涂布棒、接種環(huán)

21、、三角瓶、試管。</p><p>　　本實驗采用的主要試劑見表1。</p><p>　　表1 主要實驗試劑</p><p>　　Tab 1 Main Reagents</p><p><b>　　2.2供試菌種</b></p><p>　　金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（自備）。<

22、;/p><p><b>　　2.3培養(yǎng)基</b></p><p>　　營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（生化試劑BR）、營養(yǎng)瓊脂（生化試劑BR、國藥集團化學試劑有限公司）</p><p><b>　　2.4主要實驗設備</b></p><p>　　HH-4數顯恒溫水浴鍋（金壇市城西春蘭實驗儀器廠）、PL203電子精密天平

23、（梅特勒一托利儀器有限公司）、RE-52A旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、紫外可見分光光度計。</p><p><b>　　3 實驗方法</b></p><p><b>　　3.1原料的處理</b></p><p>　　把桑葉（Mulberry）粉碎，過100目篩，放入干燥器中備用。</p

24、><p>　　3.2培養(yǎng)基的配制 </p><p>　　營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，水1000mL，加熱溶解后分裝三角瓶內，121℃滅菌20min，備用</p><p>　　營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制：取19g的營養(yǎng)瓊脂于900mL的蒸餾水中。加熱溶解后分裝錐形瓶內，塞上蓋子，用報紙包好，于高壓滅菌鍋內滅菌（121℃，15min）后，倒于滅

25、菌好的培養(yǎng)皿內（20mL/個），冷卻，備用。</p><p>　　3.3桑葉提取液的制備</p><p>　　取粉碎好的樣品15g，加入65%乙醇450mL，置于溫度為80℃的恒溫水浴鍋中，其間要不斷的攪拌，提取1h，過濾，濾液冷藏備用。</p><p>　　將上述取得的濾液倒入旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至無乙醇，取濃縮液（樣品1）。</p><p>

26、　　桑葉提取液濃縮后（樣品1）使用極性不同的有機溶劑經行分級萃取。其步驟為：石油醚萃取，分兩層。上層為石油醚層濃縮后為石油醚相（樣品2），下層為水相。水相濃縮后再用水飽和乙酸乙酯萃取，上層為水飽和乙酸乙酯層旋轉濃縮后為水飽和乙酸乙酯相（樣品3），下層為水相。水相旋轉濃縮后再用正丁醇萃取，上層萃取液弄旋轉蒸發(fā)后為正丁醇相（樣品4），下層旋轉濃縮后濃縮為剩余相（樣品5）。（每次萃取之后的旋轉濃縮是為了排除之后在試驗中石油醚、乙酸乙酯、正丁醇

27、對供試菌抑菌作用的影響，因此，每次都要濃縮至無有機溶劑為止。另外，旋轉蒸發(fā)儀在50℃，40轉/min下使用）。操作流程見圖1。</p><p>　　3.4供試菌種的配制</p><p>　　將所有供試菌種接種于相對應的培養(yǎng)皿上平板培養(yǎng)，每種培養(yǎng)五皿。置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。每種菌株選取一皿供測試用，其余備用。</p><p><b>　　3.5

28、菌懸液的制備</b></p><p>　　用搖瓶法制備，步驟為：接種環(huán)挑取一環(huán)菌體或孢子放入裝有50mL的肉湯培養(yǎng)基三角瓶中搖勻，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出使用，然后用無菌生理鹽水稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4等不同濃度梯度的菌懸液，各吸取2mL分別加入已滅菌冷卻的平面培養(yǎng)基中涂布均勻后與30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，根據觀察菌種生長情況選取適宜的菌懸液濃度，備用。[17]&

29、lt;/p><p><b>　　取濃縮液（樣品1）</b></p><p><b>　　石油醚萃取</b></p><p><b>　　濃縮</b></p><p>　　石油醚相（樣品2） 剩余相1</p><p><b>　　水飽和乙酸乙

30、酯萃取</b></p><p><b>　　濃縮</b></p><p>　　乙酸乙酯相（樣品3） 剩余相2</p><p><b>　　正丁醇萃取</b></p><p><b>　　濃縮</b></p><p>　　正丁醇相（樣品4）

31、 剩余相3（樣品5）</p><p><b>　　圖1 萃取流程圖</b></p><p>　　Fig 1 Extraction flow chart</p><p>　　3.6濾紙片擴散法[18]</p><p>　　用無菌吸管吸取每種菌懸液0.2mL加入到上述配制好的平板中，用無菌涂布棒均勻涂布。</p&g

32、t;<p>　?。?）用無菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片分別浸入裝有各種提取物溶液的燒杯中浸濕；</p><p>　　（2）取出濾紙片時保證過濾片所含提取物溶液量基本一致，并在燒杯內壁濾去多余提取物溶液。經行無菌操作，將濾紙片貼放在平皿上；</p><p>　?。?）將上述貼好濾紙片的含菌平板倒置放于30℃溫室中，24h后取出觀察抑菌圈得大小，并記錄結果。</p>

33、<p>　　3.7標準曲線的繪制</p><p>　　用NaNO2 - A l (NO3 )3比色法，制作以蘆丁為黃酮的標準曲線[19]，具體制作方法為：準確稱取蘆丁（黃酮標準品）標準樣品0.025 g置于三角瓶中，用30%乙醇定容至250mL，得到0.1mg/mL蘆丁標準溶液。分別吸取蘆丁對照樣品1.0mL，1.5mL，2 ml，2.5mL，3.0 mL，3.5mL置于三角瓶中，加入5%的NaNO20

34、.5 mL，搖勻，放置6min后加入10%Al（NO3）3溶液0.5mL，搖勻放置6min后加入4%NaOH溶液4mL，而后將各個不同稀釋度的標準溶液用紫外—可見分光光度計在500nm處進行測定蘆丁的吸光值。</p><p>　　3.8桑葉提取物中黃酮含量的測定</p><p>　　取3.3中已經制備好的五種樣品液各1mL于試管中，稀釋10倍，備用。</p><p>

35、;　　分別取上述已稀釋好的樣品液1mL于分光光度計中測定分光光度值，記錄結果。對照3.7所制作的標準曲線查出蘆丁濃度。所得結果乘以稀釋倍（10）數即為桑葉提取液的黃酮類化合物含量。</p><p>　　桑葉提取物黃酮類化合物含量＝蘆丁濃度×稀釋倍數（10倍）</p><p>　　3.9桑葉提取液最低抑菌濃度（MIC）的測定</p><p>　　稱取正丁醇萃

36、取濃縮后所得的正丁醇相浸膏，用無菌水溶解，并過濾，制備成濃度為4.0×10-2g浸膏/mL的原始樣品溶液。采用二倍稀釋法[20]制備不同濃度梯度的樣品溶液。其步驟為：準備4支已滅菌的試管，編號，每管各加入無菌水5mL，在1號管內加入5mL 4.0×10-2g浸膏/mL的樣品液，混勻后吸取5mL到2號管，混勻后再吸取5mL到3號管，依次類推至4號管，得到待測樣品的濃度分別為1號管2.0×10-2g浸膏/mL；

37、2號管1.0×10-2g浸膏/mL；3號管0.5×10-2g浸膏/mL；4號管0.25×10-2g浸膏/mL。</p><p>　　采用瓊脂平板稀釋法，每個平皿中分別加入上述已制備好的4中不同濃度的待測樣品2mL，并加入18mL，約45℃左右的已滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻、待凝固后，每皿加入0.2mL（3.0×106cfu/mL）菌懸液，3組平行，均勻涂布，靜置20min后

38、，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，記錄結果。</p><p><b>　　4 結果與分析</b></p><p>　　4.1桑葉乙醇提取液對供試微生物的抑制作用</p><p>　　各種提取物對供試的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都有抑菌作用。實驗現象表明：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌周圍的抑菌圈界限比較明顯，有清晰的抑菌圈出現

39、，肉眼容易觀察?？梢娨志Ч麍D2和圖3。</p><p>　　圖2 乙酸乙酯相萃取物抑制大腸桿菌效果圖</p><p>　　Fig 2 Ethyl acetate inhibit the effects of E.coli</p><p>　　圖3 乙酸乙酯相萃取物抑制金黃色葡萄球菌效果圖</p><p>　　Fig 3 Ethyl

40、acetate inhibit the effects of Staphylococcus aureus</p><p>　　4.2桑葉提取液對供試微生物的抑制效果</p><p>　　4.2.1桑葉提取的抑菌圈直徑大小</p><p>　　根據3.6記錄得到5種桑葉提取液的抑菌圈直徑如表2所示：</p><p>　　表2 供試菌種形成的抑

41、菌圈直徑（mm）</p><p>　　Tab 2 The formation of the tested bacteria inhibition zone diameter（mm）</p><p>　　根據圖4可看出5種桑葉提取物對供試菌抑菌強度為：正丁醇相＞乙酸乙酯相＞濃縮液＞石油醚相＞剩余相。</p><p>　　圖4 供試菌中形成的抑菌圈直徑（mm）<

42、;/p><p>　　Fig 6 The formation of the tested bacteria inhibition zone diameter（mm）</p><p><b>　　4.2.2標準曲線</b></p><p>　　以所測得的吸光值A為縱坐標，以樣品蘆丁含量（mg/mL）為橫坐標作一條曲線，得該曲線的回歸方程為y=8.51

43、43x+0.0201，相關系數R2=0.9947。</p><p>　　圖5 蘆丁標準曲線</p><p>　　Fig 2 Rutin standard curve</p><p>　　4.2.3桑葉提取液中黃酮類化合物含量的測定</p><p>　　五種樣品稀釋液測得的吸光度值分別為：A1=0.044；A2=0.034；A3=0.0

44、52；A4=0.063；A5=0.030</p><p>　　根據4.2.2中所得的標準曲線得到的回歸方程得到桑葉提取物中黃酮類化合物含量為：濃縮液0.02（mg/mL）；石油醚相0.016（mg/mL）；乙酸乙酯相0.037（mg/mL）；正丁醇相0.050（mg/mL）；剩余相0.012（mg/mL）。</p><p>　　4.3桑葉正丁醇提取液最低抑菌濃度（MIC）</p>

45、;<p>　　用正丁醇相對其七種供試菌種進行最低抑菌濃度（MIC）結果，分別為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）0.5×10-2（g浸膏/mL），大腸桿菌（E.coli）1.0×10-2（g浸膏/mL），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）0. 5×10-2（g浸膏/mL）。</p><p><b>　　5 總結<

46、;/b></p><p>　?。?）桑葉用乙醇提取效果較好，對于桑葉中黃酮化合物的提取也有較好的優(yōu)勢。用濾紙片擴散法來觀察實驗現象，桑葉提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都有較明顯的抑菌作用。</p><p>　　（2）從實驗記錄的各種供試菌種抑菌圈直徑大小可知，用正丁醇提取的桑葉提取物抑制作用最大，并通過測定桑葉5種提取物中黃酮類化合物含量判定桑葉提取物對供試菌種的抑制

47、作用于黃酮類化合物含量具有正相關性。</p><p>　?。?）用正丁醇提取濃縮液對其3種供試菌種進行最低抑菌濃度（MIC）的測定，分別為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）0.5×10-2（g浸膏/mL），大腸桿菌（E.coli）1.0×10-2（g浸膏/mL），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）0. 5×10-2（g浸膏/mL）。<

48、/p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 鄒盛勤,陳武.桑葉的化學成分、藥理活性及應用研究進展[J].林業(yè)化工通訊,2003,37(1):22- 25.</p><p>　　[2] 白旭華.桑葉的營養(yǎng)與藥用價值及其開發(fā)應用[J].云南熱作科技,2001,24(2):37- 38.</p><p>

49、;　　[3] 趙麗君,齊鳳蘭,瞿曉華,等.桑葉的營養(yǎng)保健作用及綜合利用[J].中國食物與營養(yǎng),2004,(2):22- 25.</p><p>　　[4] Hublik G, Schinner F.Characterization and immobilization of the laccase from Pleurotus ostreatus and its use for the continuous e

50、limination of phenolic pollutants[J ]. Enzyme Microbial Technol , 2000,27:330-336.</p><p>　　[5] Xu F. Oxidation of phenols,anilines and benzenethiols by fungal laccases [J]. Micr obiol – ogy,1994,140:19-

51、20.</p><p>　　[6] 江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上海人民出版社,1997.</p><p>　　[7] 周紹堅,蘇湘敏,陳華俊,等.桑葉對小白鼠的鎮(zhèn)咳作用實驗研究江民族醫(yī)學院學報,2007.29(5):697-698.</p><p>　　[8] 楊海霞,朱祥瑞,陸洪省.桑葉保健制品開發(fā)利用研究進展[J].科技通報, 2003, 1

52、9(1): 72-76.</p><p>　　[9] 陳福君,等.桑的藥理研究（Ⅱ）—桑葉、桑枝、桑白皮抗炎藥理作用的初步比較研究.沈陽藥科大學學報,1995,36(3):222.</p><p>　　[10] 彭延古,葛金文,付燦云,等.桑葉提取液對凝血機制的影響[J].湖南中醫(yī)學院學報,2002,22(4):21—23.</p><p>　　[11] 姚連初,朱

53、麗華.桑葉注射劑的研制、質控及臨床應用[J].現代應用藥學,1996,13(4):48.</p><p>　　[12] 江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典(下冊) [M].上海:上海人民出版社,1997.</p><p>　　[13] 花蕾,張文清,趙顯峰,桑葉水提浸膏的抑菌作用研究[J]上海生物醫(yī)學工程.2007.28(1):16-18.</p><p>　　[14] 裘炳

54、毅,化妝品化學與技術大全（上）,P390-410.</p><p>　　[15] Sudo M Kuramoto H,Iso M.Studies on functional poultry eggs.E ffects of mulberry leaves on quantity of eggs[R].Bull Ibaraki Poultry Experiment Station,2000(33):21-34.&l

55、t;/p><p>　　[16] 嚴冰.桑葉作為氨化稻草日糧蛋白質補充料的效果研究[D].浙江:浙江大學,2000.</p><p>　　[17] 趙斌,何紹江,等.微生物學實驗[M].北京:科學出版社,2002:217-219.</p><p>　　[18] 王洪新,呂源玲.黃荊葉抑菌作用及抑菌成分分析[J].中國野生植物源,2003,22(1):35~37.</