桑葉中不同提取物抑菌作用的研究【畢業(yè)論文】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　桑葉中不同提取物抑菌作用的研究</p><p><b>　　摘 要</b>&l

2、t;/p><p>　　本論文研究了桑葉（Mulberry）對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)從觀察供試菌種的生長(zhǎng)情況、抑菌圈直徑長(zhǎng)度、桑葉提取物最低抑菌濃度（MIC）這幾個(gè)方面來(lái)進(jìn)行研究。通過(guò)濾紙片擴(kuò)散法觀察5種提取物（濃縮液、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、剩余相）對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphy

3、lococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的抑菌效果，并測(cè)定其抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：桑葉提取液對(duì)供試金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）都有明顯的抑菌效果，抑菌強(qiáng)度為：正丁醇相＞乙酸乙酯相＞濃縮液＞石油醚相＞剩余相。并且，用正丁醇相對(duì)其三種供試菌種進(jìn)行最低抑菌濃度（

4、MIC）的測(cè)定，分別為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）0.5×10-2（g浸膏/mL），大腸桿菌（E.coli）1.0×10-2（g</p><p>　　本文又對(duì)桑葉各提取物中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了含量測(cè)定，顯示桑葉提取物中黃酮類(lèi)化合物含量與提取物對(duì)供試菌種的抑制作用存在著一定正相關(guān)性。桑葉提取物中所含黃酮類(lèi)化合物越高，抑菌效果越好。</p><p

5、>　　關(guān)鍵詞：桑葉；黃酮；抑菌；提取液；MIC；分級(jí)萃取</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In this study,we analyzed the inhibitory effect of the Mulberry leaves on Staphylococcus aureus, E.coli and Bacillus

6、 subtilis. The experiment researched the growth, length of inhibition zone diameter and MIC.We observed five extract (concentrated liquid, petroleum ether, ethyl acetate, butanol phase, and the remaining phase) which eff

7、ected on the inhibitory of Staphylococcus aureus, E.coli and Bacillus subtilis by filter paper diffusion method, and recorded results. The results showed that: mulb</p><p>　　Flavonoids content in different f

8、ractions were determined .The results showed that the relationship between flavonoid content and antibacterial avtivity was a certain positive correlation. </p><p>　　Keywords: mulberry; flavonoids; antibacte

9、rial; extract; MIC; grade extraction</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料2</b></p><p>　　2.1材料、試劑與儀器2</p

10、><p><b>　　2.2供試菌種2</b></p><p><b>　　2.3培養(yǎng)基2</b></p><p>　　2.4主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備2</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法3</b></p><p>　　3.1原料的處理3</p&g

11、t;<p>　　3.2培養(yǎng)基的配制3</p><p>　　3.3桑葉提取液的制備3</p><p>　　3.4供試菌種的配制3</p><p>　　3.5菌懸液的制備3</p><p>　　3.6濾紙片擴(kuò)散法4</p><p>　　3.7標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制4</p><p>

12、;　　3.8桑葉提取物中黃酮含量的測(cè)定5</p><p>　　3.9桑葉提取液最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定5</p><p><b>　　4 結(jié)果與分析5</b></p><p>　　4.1桑葉乙醇提取液對(duì)供試微生物的抑制作用5</p><p>　　4.2桑葉提取液對(duì)供試微生物的抑制效果7</p>

13、<p>　　4.2.1桑葉提取的抑菌圈直徑大小7</p><p>　　4.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)8</p><p>　　4.2.3桑葉提取液中黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定8</p><p>　　4.3桑葉正丁醇提取液最低抑菌濃度（MIC）8</p><p><b>　　5 總結(jié)8</b></p>&

14、lt;p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b></p><p>　　致 謝錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　附錄1 文獻(xiàn)綜述錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　附錄2 外文翻譯錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p><b>　　1 前言</b></p><p&g

15、t;　　桑葉（Mulberry）原產(chǎn)于我國(guó)和朝鮮。如今在全球大約有16種，現(xiàn)分布于北溫帶、亞洲熱帶和非洲熱帶及美洲地區(qū)。我國(guó)就約有11種，分布于全國(guó)大部分地區(qū)，以江蘇、浙江等南方養(yǎng)蠶地區(qū)產(chǎn)量較大[1]。我國(guó)是世界上最大的桑樹(shù)種植國(guó)，桑樹(shù)在我國(guó)已有4000多年的歷史，主要有白桑（Morus alba）、華桑(M.cathayana)、山桑(M.diabolica)、蒙桑(M.Mongolic)等10多個(gè)品種。[2]</p>

16、<p>　　桑葉是?？浦参锷５母稍锶~，又有別名為家桑、荊桑、桑椹樹(shù)、黃桑等，其品質(zhì)優(yōu)越，資源豐富，一般在初霜后采收。桑葉可以用來(lái)養(yǎng)蠶，也是防沙固沙的植物，同時(shí)也可以用于藥理，在我國(guó)是一味常見(jiàn)的中藥藥材，中醫(yī)又稱(chēng)之為“鐵扇子”[3]。桑葉自古以來(lái)就被人認(rèn)為有疏散風(fēng)熱，清肺潤(rùn)燥，平抑肝陽(yáng)，清肝明目，涼血止血的功效[4-5]。經(jīng)現(xiàn)代的藥理理論和臨床試驗(yàn)證明，桑葉對(duì)降血糖、降血脂、降膽固醇有明顯療效；還可解痙、抗?jié)僛6]、鎮(zhèn)咳[7]

17、、清楚自由基，抗衰老[8]、抗病毒、抗炎[9]、抗菌、抗凝血[10]，并對(duì)絲蟲(chóng)病有預(yù)防作用[11]，改善消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)[12]的功能。</p><p>　　桑葉具有抑菌作用，主要是由于酚類(lèi)物質(zhì)破壞了細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞釋放胞內(nèi)成分，引起膜的電子傳遞、營(yíng)養(yǎng)吸收、核苷酸合成及ATP活性等功能障礙，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。桑葉中含有多種酚類(lèi)化合物，主要是黃酮類(lèi)化合物，如槲皮素、蕓香苷等[13]。桑

18、葉水抽提液濃度（31mg/mL）體外有抗鉤端螺旋體作用，桑葉中的植物防御素有抗微生物作用。</p><p>　　桑葉除了在藥理上具有應(yīng)用價(jià)值外，還在化妝品方面作為原料。近年來(lái)的研究證明，桑葉有良好的護(hù)膚美容作用[14]，特別是對(duì)臉部的痤瘡、褐色斑都有比較好的療效。對(duì)改善和調(diào)節(jié)皮膚組織的新陳代謝，特別是抑制色素沉著的發(fā)生和發(fā)展均具有良好的作用。此外，用桑葉沐浴也是很好的美容浴方。它性涼滋潤(rùn)，護(hù)膚而不脫脂，對(duì)皮膚粗糙

19、的人是絕佳的選擇。</p><p>　　用桑葉混合而成的飼料具有很多優(yōu)點(diǎn)，并在畜牧業(yè)上的應(yīng)用日趨廣泛。給雞喂桑葉飼料可改善其肉質(zhì)、香味、和口感[15]。此外。嚴(yán)冰等[16]研究表明反芻動(dòng)物對(duì)桑葉有很高的消化率。</p><p>　　因此桑葉是一類(lèi)具有較高開(kāi)發(fā)價(jià)值的物質(zhì)，它既可防治疫病，又能促進(jìn)生長(zhǎng)，還可節(jié)約飼料，提高效益，可謂是一舉數(shù)得。根據(jù)桑葉的抑菌性質(zhì)，本論文對(duì)其從觀察供試菌種的生長(zhǎng)情

20、況、抑菌圈直徑長(zhǎng)度、桑葉正丁醇提取物最低抑菌濃度（MIC）以及提取液中黃酮含量對(duì)抑菌作用的正相關(guān)性這幾個(gè)方面進(jìn)行了研究分析。</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)主要儀器與材料</p><p><b>　　2.1試劑與儀器</b></p><p>　　桑葉（Mulberry）(購(gòu)于藥房中)；分液漏斗、酒精燈、電磁爐、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、涂布棒、接種環(huán)

21、、三角瓶、試管。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用的主要試劑見(jiàn)表1。</p><p>　　表1 主要實(shí)驗(yàn)試劑</p><p>　　Tab 1 Main Reagents</p><p><b>　　2.2供試菌種</b></p><p>　　金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（自備）。<

22、;/p><p><b>　　2.3培養(yǎng)基</b></p><p>　　營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（生化試劑BR）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（生化試劑BR、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）</p><p><b>　　2.4主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備</b></p><p>　　HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠）、PL203電子精密天平

23、（梅特勒一托利儀器有限公司）、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　3.1原料的處理</b></p><p>　　把桑葉（Mulberry）粉碎，過(guò)100目篩，放入干燥器中備用。</p

24、><p>　　3.2培養(yǎng)基的配制 </p><p>　　營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，水1000mL，加熱溶解后分裝三角瓶?jī)?nèi)，121℃滅菌20min，備用</p><p>　　營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配制：取19g的營(yíng)養(yǎng)瓊脂于900mL的蒸餾水中。加熱溶解后分裝錐形瓶?jī)?nèi)，塞上蓋子，用報(bào)紙包好，于高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌（121℃，15min）后，倒于滅

25、菌好的培養(yǎng)皿內(nèi)（20mL/個(gè)），冷卻，備用。</p><p>　　3.3桑葉提取液的制備</p><p>　　取粉碎好的樣品15g，加入65%乙醇450mL，置于溫度為80℃的恒溫水浴鍋中，其間要不斷的攪拌，提取1h，過(guò)濾，濾液冷藏備用。</p><p>　　將上述取得的濾液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至無(wú)乙醇，取濃縮液（樣品1）。</p><p>

26、　　桑葉提取液濃縮后（樣品1）使用極性不同的有機(jī)溶劑經(jīng)行分級(jí)萃取。其步驟為：石油醚萃取，分兩層。上層為石油醚層濃縮后為石油醚相（樣品2），下層為水相。水相濃縮后再用水飽和乙酸乙酯萃取，上層為水飽和乙酸乙酯層旋轉(zhuǎn)濃縮后為水飽和乙酸乙酯相（樣品3），下層為水相。水相旋轉(zhuǎn)濃縮后再用正丁醇萃取，上層萃取液弄旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后為正丁醇相（樣品4），下層旋轉(zhuǎn)濃縮后濃縮為剩余相（樣品5）。（每次萃取之后的旋轉(zhuǎn)濃縮是為了排除之后在試驗(yàn)中石油醚、乙酸乙酯、正丁醇

27、對(duì)供試菌抑菌作用的影響，因此，每次都要濃縮至無(wú)有機(jī)溶劑為止。另外，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃，40轉(zhuǎn)/min下使用）。操作流程見(jiàn)圖1。</p><p>　　3.4供試菌種的配制</p><p>　　將所有供試菌種接種于相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿上平板培養(yǎng)，每種培養(yǎng)五皿。置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。每種菌株選取一皿供測(cè)試用，其余備用。</p><p><b>　　3.5

28、菌懸液的制備</b></p><p>　　用搖瓶法制備，步驟為：接種環(huán)挑取一環(huán)菌體或孢子放入裝有50mL的肉湯培養(yǎng)基三角瓶中搖勻，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出使用，然后用無(wú)菌生理鹽水稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4等不同濃度梯度的菌懸液，各吸取2mL分別加入已滅菌冷卻的平面培養(yǎng)基中涂布均勻后與30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，根據(jù)觀察菌種生長(zhǎng)情況選取適宜的菌懸液濃度，備用。[17]&

29、lt;/p><p><b>　　取濃縮液（樣品1）</b></p><p><b>　　石油醚萃取</b></p><p><b>　　濃縮</b></p><p>　　石油醚相（樣品2） 剩余相1</p><p><b>　　水飽和乙酸乙

30、酯萃取</b></p><p><b>　　濃縮</b></p><p>　　乙酸乙酯相（樣品3） 剩余相2</p><p><b>　　正丁醇萃取</b></p><p><b>　　濃縮</b></p><p>　　正丁醇相（樣品4）

31、 剩余相3（樣品5）</p><p><b>　　圖1 萃取流程圖</b></p><p>　　Fig 1 Extraction flow chart</p><p>　　3.6濾紙片擴(kuò)散法[18]</p><p>　　用無(wú)菌吸管吸取每種菌懸液0.2mL加入到上述配制好的平板中，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布。</p&g

32、t;<p>　?。?）用無(wú)菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片分別浸入裝有各種提取物溶液的燒杯中浸濕；</p><p>　　（2）取出濾紙片時(shí)保證過(guò)濾片所含提取物溶液量基本一致，并在燒杯內(nèi)壁濾去多余提取物溶液。經(jīng)行無(wú)菌操作，將濾紙片貼放在平皿上；</p><p>　?。?）將上述貼好濾紙片的含菌平板倒置放于30℃溫室中，24h后取出觀察抑菌圈得大小，并記錄結(jié)果。</p>

33、<p>　　3.7標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制</p><p>　　用NaNO2 - A l (NO3 )3比色法，制作以蘆丁為黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[19]，具體制作方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆?。S酮標(biāo)準(zhǔn)品）標(biāo)準(zhǔn)樣品0.025 g置于三角瓶中，用30%乙醇定容至250mL，得到0.1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蘆丁對(duì)照樣品1.0mL，1.5mL，2 ml，2.5mL，3.0 mL，3.5mL置于三角瓶中，加入5%的NaNO20

34、.5 mL，搖勻，放置6min后加入10%Al（NO3）3溶液0.5mL，搖勻放置6min后加入4%NaOH溶液4mL，而后將各個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)在500nm處進(jìn)行測(cè)定蘆丁的吸光值。</p><p>　　3.8桑葉提取物中黃酮含量的測(cè)定</p><p>　　取3.3中已經(jīng)制備好的五種樣品液各1mL于試管中，稀釋10倍，備用。</p><p>

35、;　　分別取上述已稀釋好的樣品液1mL于分光光度計(jì)中測(cè)定分光光度值，記錄結(jié)果。對(duì)照3.7所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出蘆丁濃度。所得結(jié)果乘以稀釋倍（10）數(shù)即為桑葉提取液的黃酮類(lèi)化合物含量。</p><p>　　桑葉提取物黃酮類(lèi)化合物含量＝蘆丁濃度×稀釋倍數(shù)（10倍）</p><p>　　3.9桑葉提取液最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定</p><p>　　稱(chēng)取正丁醇萃

36、取濃縮后所得的正丁醇相浸膏，用無(wú)菌水溶解，并過(guò)濾，制備成濃度為4.0×10-2g浸膏/mL的原始樣品溶液。采用二倍稀釋法[20]制備不同濃度梯度的樣品溶液。其步驟為：準(zhǔn)備4支已滅菌的試管，編號(hào)，每管各加入無(wú)菌水5mL，在1號(hào)管內(nèi)加入5mL 4.0×10-2g浸膏/mL的樣品液，混勻后吸取5mL到2號(hào)管，混勻后再吸取5mL到3號(hào)管，依次類(lèi)推至4號(hào)管，得到待測(cè)樣品的濃度分別為1號(hào)管2.0×10-2g浸膏/mL；

37、2號(hào)管1.0×10-2g浸膏/mL；3號(hào)管0.5×10-2g浸膏/mL；4號(hào)管0.25×10-2g浸膏/mL。</p><p>　　采用瓊脂平板稀釋法，每個(gè)平皿中分別加入上述已制備好的4中不同濃度的待測(cè)樣品2mL，并加入18mL，約45℃左右的已滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻、待凝固后，每皿加入0.2mL（3.0×106cfu/mL）菌懸液，3組平行，均勻涂布，靜置20min后

38、，置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，記錄結(jié)果。</p><p><b>　　4 結(jié)果與分析</b></p><p>　　4.1桑葉乙醇提取液對(duì)供試微生物的抑制作用</p><p>　　各種提取物對(duì)供試的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都有抑菌作用。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌周?chē)囊志缦薇容^明顯，有清晰的抑菌圈出現(xiàn)

39、，肉眼容易觀察?？梢?jiàn)抑菌效果圖2和圖3。</p><p>　　圖2 乙酸乙酯相萃取物抑制大腸桿菌效果圖</p><p>　　Fig 2 Ethyl acetate inhibit the effects of E.coli</p><p>　　圖3 乙酸乙酯相萃取物抑制金黃色葡萄球菌效果圖</p><p>　　Fig 3 Ethyl

40、acetate inhibit the effects of Staphylococcus aureus</p><p>　　4.2桑葉提取液對(duì)供試微生物的抑制效果</p><p>　　4.2.1桑葉提取的抑菌圈直徑大小</p><p>　　根據(jù)3.6記錄得到5種桑葉提取液的抑菌圈直徑如表2所示：</p><p>　　表2 供試菌種形成的抑

41、菌圈直徑（mm）</p><p>　　Tab 2 The formation of the tested bacteria inhibition zone diameter（mm）</p><p>　　根據(jù)圖4可看出5種桑葉提取物對(duì)供試菌抑菌強(qiáng)度為：正丁醇相＞乙酸乙酯相＞濃縮液＞石油醚相＞剩余相。</p><p>　　圖4 供試菌中形成的抑菌圈直徑（mm）<

42、;/p><p>　　Fig 6 The formation of the tested bacteria inhibition zone diameter（mm）</p><p><b>　　4.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)</b></p><p>　　以所測(cè)得的吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以樣品蘆丁含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)作一條曲線(xiàn)，得該曲線(xiàn)的回歸方程為y=8.51

43、43x+0.0201，相關(guān)系數(shù)R2=0.9947。</p><p>　　圖5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)</p><p>　　Fig 2 Rutin standard curve</p><p>　　4.2.3桑葉提取液中黃酮類(lèi)化合物含量的測(cè)定</p><p>　　五種樣品稀釋液測(cè)得的吸光度值分別為：A1=0.044；A2=0.034；A3=0.0

44、52；A4=0.063；A5=0.030</p><p>　　根據(jù)4.2.2中所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到的回歸方程得到桑葉提取物中黃酮類(lèi)化合物含量為：濃縮液0.02（mg/mL）；石油醚相0.016（mg/mL）；乙酸乙酯相0.037（mg/mL）；正丁醇相0.050（mg/mL）；剩余相0.012（mg/mL）。</p><p>　　4.3桑葉正丁醇提取液最低抑菌濃度（MIC）</p>

45、;<p>　　用正丁醇相對(duì)其七種供試菌種進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）結(jié)果，分別為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）0.5×10-2（g浸膏/mL），大腸桿菌（E.coli）1.0×10-2（g浸膏/mL），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）0. 5×10-2（g浸膏/mL）。</p><p><b>　　5 總結(jié)<

46、;/b></p><p>　　（1）桑葉用乙醇提取效果較好，對(duì)于桑葉中黃酮化合物的提取也有較好的優(yōu)勢(shì)。用濾紙片擴(kuò)散法來(lái)觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，桑葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都有較明顯的抑菌作用。</p><p>　?。?）從實(shí)驗(yàn)記錄的各種供試菌種抑菌圈直徑大小可知，用正丁醇提取的桑葉提取物抑制作用最大，并通過(guò)測(cè)定桑葉5種提取物中黃酮類(lèi)化合物含量判定桑葉提取物對(duì)供試菌種的抑制

47、作用于黃酮類(lèi)化合物含量具有正相關(guān)性。</p><p>　　（3）用正丁醇提取濃縮液對(duì)其3種供試菌種進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定，分別為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）0.5×10-2（g浸膏/mL），大腸桿菌（E.coli）1.0×10-2（g浸膏/mL），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）0. 5×10-2（g浸膏/mL）。<

48、/p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 鄒盛勤,陳武.桑葉的化學(xué)成分、藥理活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].林業(yè)化工通訊,2003,37(1):22- 25.</p><p>　　[2] 白旭華.桑葉的營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用[J].云南熱作科技,2001,24(2):37- 38.</p><p>

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