畢業(yè)論文陳皮提取物中多甲氧基黃酮的分離分析方法研究

1、<p>　　HUANGGANG NORMAL UNIVERSITY</p><p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p>　　BACHELOR DISSERTATION</p><p>　　陳皮提取物中多甲氧基黃酮的分離分析方法研究</p><p>　　ANALYSIS METHOD FOR SE

2、PARATING CITRUS EXTRACTS OF POLYMETHOXYLATED FLAVONES</p><p><b>　　中國(guó) 黃州</b></p><p>　　HUANGZHOU，CHINA</p><p><b>　　二○一四年五月</b></p><p><b>　　

3、MAY，2014</b></p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘 要1</b></p><p>　　ABSTRACT2</p><p><b>　　1前言3</b></p><p><b&g

4、t;　　1.1性狀3</b></p><p><b>　　1.2化學(xué)成分3</b></p><p>　　1.2.1黃酮類3</p><p>　　1.2.2揮發(fā)油類4</p><p>　　1.2.3檸檬苦素類4</p><p>　　1.2.4微量元素及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)4</p&

5、gt;<p>　　1.2.5生物堿類5</p><p>　　1.2.6其它成分5</p><p>　　1.3硅膠柱層析法5</p><p>　　1.4選題的目的和意義5</p><p><b>　　2 材料與方法6</b></p><p>　　2.1儀器與試劑6</

6、p><p>　　2.1.1 試劑6</p><p>　　2.1.2 儀器6</p><p>　　2.2柱層析機(jī)理6</p><p>　　2.3 實(shí)驗(yàn)步驟6</p><p>　　2.4提取條件的的確定7</p><p>　　2.4.1提取方法對(duì)黃酮類化合物提取率的影響7</p>

7、<p>　　2.4.2乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響7</p><p>　　2.4.3提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響7</p><p>　　2.5川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線7</p><p><b>　　3結(jié)果與討論8</b></p><p>　　3.1提取條件的探究8</p>

8、<p>　　3.1.1提取方法對(duì)黃酮類化合物提取率結(jié)果與分析8</p><p>　　3.1.2乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物提取率結(jié)果與分析8</p><p>　　3.1.3提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率結(jié)果與分析9</p><p>　　3.2川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線9</p><p>　　3.3HPLC檢測(cè)結(jié)果分析10<

9、;/p><p><b>　　4結(jié)果與討論17</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)19</b></p><p><b>　　致謝21</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本文以陳皮中黃

10、酮類化合物的提取，分離純化和檢測(cè)為目的。運(yùn)用索氏提取法，加熱回流法，浸提法三種方法提?。谎芯苛瞬煌瑵舛纫掖妓芤?，不同提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響。然后以三氯甲烷為萃取劑，萃取出陳皮中的多甲氧基黃酮類化合物，再以硅膠為吸附劑，乙酸乙酯和石油醚的混合液為洗脫劑，采用柱色譜法分離多甲氧基黃酮類化合物，做HPLC檢測(cè)，最終得到陳皮素，3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮，橘皮素等7種黃酮類化合物。</p><

11、p>　　關(guān)鍵詞：黃酮類化合物；多甲氧基黃酮類化合物；川陳皮素；分離純化</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p><p>　　In this paper, orange peel extract flavonoids, purification and detection purposes. Using soxhlet extraction,

12、 heating reflux, extraction of three methods for txtracting,effects of different concentrations of aqueous ethanol, effect of different extraction time on the extraction rate of flavonoids. Then chloroform as extracting

13、agent, extracted in the polymethoxylated flavonoids, then silicagel as adsorbent, a mixture of ethyl acetate and petroleum ether as eluent, column chromatography using pol</p><p>　　Keywords: Flavonoids;

14、 Polymethoxylated flavonoids; Nobiletin; Separation and purification</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　陳皮，別名橘皮，廣陳皮，是蕓香科植物及其變種栽培的干燥成熟果皮，氣香，性溫，歸肺、脾經(jīng)，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的常用藥，近年來(lái)陳皮的現(xiàn)代

15、研究比較廣泛，就其藥理作用，大多從陳皮的整體角度來(lái)研究或總結(jié)，而陳皮的各類化學(xué)成分的作用研究的較少，本文著眼于此，以更好更有利于陳皮的研究和應(yīng)用。</p><p><b>　　1.1性狀</b></p><p>　　陳皮:常剝成數(shù)瓣，基部相連，有的呈不規(guī)則的片狀，厚1~4 mm。外表面呈橙紅色或紅棕色，有細(xì)皺紋及凹下的點(diǎn)狀油室粗糙，附黃白色或黃棕色筋絡(luò)狀維管束。質(zhì)稍硬

16、而脆內(nèi)表面為淺黃白色，氣香，味辛、苦。</p><p>　　廣陳皮:常3瓣相連，形狀整齊，厚度均勻，約1 mm。點(diǎn)狀油室較大，對(duì)光照視，透明清晰，質(zhì)較柔軟[1]。</p><p><b>　　1.2化學(xué)成分</b></p><p>　　現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)了陳皮很多化學(xué)成分，主要有黃酮類化合物、揮發(fā)油類、檸檬苦素類、生物堿類和微量元素（鈣、鉀、鎂、

17、鈉、鋰、鐵、鋅、錳等）等，近幾年還發(fā)現(xiàn)了一些新的化學(xué)成分，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（維生素B1、維生素C、類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)等）。</p><p><b>　　1.2.1黃酮類</b></p><p>　　作為陳皮的一大類生理活性成分，黃酮類化合物被分離和鑒定的種類有很多,主要有黃酮、黃烷酮、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、及多甲氧基黃酮類化合物等。</p>

18、<p>　　石力夫等[2]對(duì)橘果皮的化學(xué)成分研究，得到了橙皮苷，由橙皮苷元和一分子蕓香糖構(gòu)成的一種單氧甲基的黃烷酮類。武井等[3]從陳皮中分離并鑒定了新橙皮苷、柚皮苷以及蕓香柚皮苷。Jie Chen[4]等分離得到了十種多甲氧黃酮，包括 7-羥基-3,5,6,3′,4′-五甲氧基黃酮和7-羥基-3,5,6,8,3′,4′-六甲基黃酮這兩種新成分。錢(qián)士輝等[5]鑒定出三種黃酮類成分，atsudaidai，川陳皮素，七甲氧基黃酮。

19、</p><p>　　陳皮中有大量且豐富的黃酮類化合物，在陳皮的作用中占重要位置，有清除自由基、羥氧化基及抗氧化的能力。對(duì)因自由基而導(dǎo)致的細(xì)胞膜氧化具有一定的保護(hù)作用。近幾年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),桔皮中特有的多甲氧基類黃酮成分抑制腫瘤作用明顯[6]，橙皮苷的抗脂質(zhì)氧化作用能防止因紫外線而引起的皮膚癌和紅斑，為開(kāi)發(fā)研究防曬化妝品提供天然原料[7]。橙皮苷能通過(guò)抑制精細(xì)胞中透明酸酶活性，阻止其與卵細(xì)胞交會(huì)，而達(dá)到避孕效果，在停

20、止服用后 48 h 可恢復(fù)懷孕，且副作用甚微[8]。</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)研究方面，蘇丹等[9]經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，陳皮能延長(zhǎng)果蠅的最高和平均壽命，并且其對(duì)于雌蠅的延長(zhǎng)壽命作用藥比人參皂苷更優(yōu)，王新嘉等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論：橙皮苷對(duì)于病因是糖尿病而引起的神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟方面的并發(fā)癥有預(yù)防作用，且通過(guò)對(duì)比，這樣的作用與陽(yáng)性藥物的氨基胍是相似的。</p><p><b>　　1.

21、2.2揮發(fā)油類</b></p><p>　　陳皮中的揮發(fā)油含量約占1%-3%，主要包括γ-松油烯、檸檬烯、a-蒎烯和β-月桂烯等。</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)研究方面，王堅(jiān)等[11]探討了重慶大紅袍的紅橘的陳皮揮發(fā)油，通過(guò)采用 GC-MS分析技術(shù)和蒸餾法共定性定量檢測(cè)出了組分70種，13個(gè)單萜烯，是量比較大的一類化合物，結(jié)果含量高的5個(gè)分別為：檸檬烯、芳樟醇、百里香酚、γ-萜品

22、烯、α-甜橙醛，除此之外，百里香酚甲醚、α-松油的含量也大于1%，這篇文獻(xiàn)針對(duì)陳皮揮發(fā)油研究的是較全面的。周欣等[12]對(duì)不同產(chǎn)地的陳皮的揮發(fā)油進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的陳皮揮發(fā)油都含有檸檬烯、A-蒎烯、B-月桂烯、C-松油烯、B-蒎烯、癸醛、1-A-松油醇、A-異松油烯等主要成分，另外發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油的成分中，檸檬烯的含量是最高的。蔡周權(quán)等[13]通過(guò)豚鼠和家兔實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論：陳皮揮發(fā)油具有一定的抗過(guò)敏、鎮(zhèn)咳、平喘、抗變應(yīng)炎癥的作用。這與陳

23、皮歸肺經(jīng)，是相吻合的。徐彭等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，陳皮揮發(fā)油對(duì)于離體的兔腸，能明顯抑制其收縮性。這與陳皮能理氣健脾相一致，因?yàn)橘A存久的陳皮揮發(fā)性會(huì)減輕，能減少對(duì)胃腸的抑制。</p><p>　　1.2.3 檸檬苦素類</p><p>　　檸檬苦素類化合物屬于柑橘科植物的代謝產(chǎn)物，目前對(duì)這類物質(zhì)研究比較廣泛，其中檸檬苦素、奧巴叩酮以及諾米林含量較為豐富，這是一種有高度氧化性的四環(huán)三萜類化合物

24、，通常以糖苷和苷元兩種方式存在，引起苦味的原因主要是其中的中性類苷元水溶性比較差[15]，但是酸性檸檬苦素類化合物卻恰好相反，能溶于水，并且很少有苦味，研究表明，檸檬苦素類似物的結(jié)構(gòu)在加工過(guò)程中容易變化，主要因素有：溫度、光和溫度的接觸時(shí)間及pH值，這些因素會(huì)影響檸檬苦素類物質(zhì)的穩(wěn)定性和活性，在pH值為5~7時(shí)，相對(duì)比較穩(wěn)定。</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)研究方面，丁曉雯[16]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出：檸檬苦素類化合物有

25、抗肝癌、口腔癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌等，并且其作用比他莫昔芬的作用強(qiáng)。方修貴等[17]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬苦素類化合物有鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗病毒、降低膽固醇、防止動(dòng)脈粥樣硬化、抗瘧疾、殺蟲(chóng)等作用。</p><p>　　1.2.4微量元素及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)</p><p>　　陳皮中含有Mn、Fe、Ti、Cr、K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Sr、Mo 等多種微量元素，有資料報(bào)道，加工制品

26、要比先鮮橘皮中的鋅、鐵含量要高，并且桔皮中的鈣、鉀、鐵、鎂、鋅的含量要比果肉中的含量高得多[18]，并且陳皮中含有豐富的維生素 C、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素，其含量要高于果汁，且這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是人體必需的。在實(shí)驗(yàn)研究方面，研究表明，陳皮注射液能明顯增強(qiáng)豚鼠血清抗體滴度、溶血酶含量，在一定程度上，有促進(jìn)細(xì)胞免疫和體液免疫的作用[19]。另外，單味陳皮及人參配伍陳皮能顯著延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間，并且能明顯降低小鼠游泳后50 min血乳酸水平，且單味陳皮

27、組效果是最明顯的，這反映了陳皮的抗疲勞作用[20]?；诖?，根據(jù)中醫(yī)學(xué)的理論，有學(xué)者認(rèn)為陳皮是有補(bǔ)益作用的。</p><p>　　在實(shí)驗(yàn)研究方面，楊曉霞等用陳皮中的微量元素硒9.5*10-4 mol/L對(duì)豚鼠進(jìn)行心室灌流，結(jié)果明顯延長(zhǎng)心肌動(dòng)作電位幅度，還能拮抗興奮性降低等異常生理現(xiàn)象[21]，這反映了陳皮有一定的抗休克、強(qiáng)心作用。</p><p><b>　　1.2.5生物堿類&

28、lt;/b></p><p>　　研究表明，目前從柑橘屬植物中已經(jīng)分得二十多種生物堿類成分。陳皮中主要生物堿類成分是辛弗林和 N-甲基酪胺。辛弗林這類生物堿能抑制離體兔小腸運(yùn)動(dòng)，對(duì)大鼠有明顯的升壓作用,而且有作用迅速、消除快的特點(diǎn)[22]。</p><p><b>　　1.2.6其它成分</b></p><p>　　陳皮還含有多酚類、果膠

29、（含量15%-30%）、肌醇[23]等類成分。顧國(guó)明等[24]從橘皮中首次得到麝香草酚和β-谷甾醇。</p><p><b>　　1.3硅膠柱層析法</b></p><p>　　硅膠柱層析是實(shí)驗(yàn)室分離黃酮類化合物常用的分離方法之一。洗脫劑一般用甲醇和二氯甲烷的混合試劑，比例隨著所分離的化合物的極性而隨之變換，也可以用梯度洗脫的方法進(jìn)行洗脫。但當(dāng)黃酮類化合物極性較大時(shí)，

30、在反復(fù)硅膠柱層析的過(guò)程中樣品損失會(huì)比較多，分離效果也常不夠理想。</p><p>　　1.4選題的目的和意義</p><p>　　功能性食品的研究與開(kāi)發(fā)是近年來(lái)食品領(lǐng)域的發(fā)展前沿，代表著2l世紀(jì)食品的一種發(fā)展潮流。新世紀(jì)人們對(duì)健康的意識(shí)變得越來(lái)越強(qiáng)對(duì)飲食的要求也越來(lái)越高，期待通過(guò)攝食一些有益于健康的食品或功能性食品來(lái)達(dá)到預(yù)防疾病或促進(jìn)健康的作用。</p><p>　

31、　黃酮類化合物具有抗氧化、抗過(guò)敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝作用，保護(hù)心腦血管系統(tǒng)和抗病毒以及殺蟲(chóng)等廣泛的生理活性，且毒性較低，還可以用作食品、化妝品的天然添加劑，如甜味劑、抗氧化劑、食用色素等，市場(chǎng)前景廣闊。黃酮類化合物的研究開(kāi)展較早，目前，市場(chǎng)上開(kāi)發(fā)的黃酮類產(chǎn)品主要有功能食品、功能性食品添加劑、藥物中間體等。</p><p>　　本課題運(yùn)用各種現(xiàn)代提取技術(shù)、分離技術(shù)和精制方法，對(duì)陳皮中的黃酮類活性成分進(jìn)

32、行分離與純化。一方面，分離純化出黃酮單體化合物，為開(kāi)發(fā)功能產(chǎn)品，以及新型、高效、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥物奠定一定的基礎(chǔ)；另一方面，可充分利用和開(kāi)發(fā)枳實(shí)資源，增加其附加價(jià)值，提高其經(jīng)濟(jì)效益，有助于打開(kāi)市場(chǎng)，帶動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1儀器與試劑</b></p>

33、;<p><b>　　2.1.1 試劑</b></p><p><b>　　原料：陳皮</b></p><p>　　試劑：無(wú)水乙醇，蒸餾水，三氯甲烷，石油醚，乙酸乙酯，色譜乙腈</p><p><b>　　2.1.2 儀器</b></p><p>　　GWX-96

34、23MBE電熱鼓風(fēng)干燥 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠</p><p>　　DZF-6020MBE真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠</p><p>　　2XZ-1型旋片式真空泵 臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司</p><p>　　CCA-20低溫冷卻水循環(huán)泵 鞏義

35、市予華儀器有限責(zé)任公司</p><p>　　RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀　　 上海亞榮生化儀器廠</p><p>　　SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵　　 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司</p><p>　　DS-5510DT超聲波清洗器　 上海生析超聲儀器有限公司</p><p>　　

36、ZF7三用紫外分析儀　　 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司</p><p>　　JY10002電子天平　　 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司</p><p>　　Paratons Module 2695高效液相色譜儀 Waters公司</p><p><b>　　2.2柱層析機(jī)理</b>&

37、lt;/p><p>　　吸附柱層析是利用吸附劑對(duì)混合式樣各組分的吸附力不同而使各組分分離。當(dāng)采用溶劑洗脫時(shí)，發(fā)生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的過(guò)程，吸附力較強(qiáng)的組分，移動(dòng)的距離小，后出柱；吸附力較弱的組分，移動(dòng)的距離大，先出柱。</p><p><b>　　2.3 實(shí)驗(yàn)步驟</b></p><p>　　提?。喝∫欢恳掖妓芤号c陳皮粉末，用乙醇

38、提取橙皮中的物質(zhì)，再將乙醇溶液過(guò)濾，將得到的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸為稠狀物。</p><p>　　萃?。簩⒊頎钗镉眠m量的蒸餾水溶解，再加入萃取劑氯仿適量，猛烈震蕩數(shù)分鐘，靜置一段時(shí)間，取下層液，蒸干，得多黃酮類化合物提取物。</p><p>　　裝柱：取1.6 g黃酮類化合物提取物溶于少量三氯甲烷。取一定量200-300目的硅膠于燒杯中，加入適量石油醚，攪拌，以濕法裝柱裝入6*30層析柱中，再

39、加入適量海沙，硅膠和海沙表面均要保持水平，待到石油醚液面到達(dá)海沙表面時(shí)，開(kāi)始加入黃酮粗提取物溶液。</p><p>　　洗脫：待該溶液完全流入石油醚后，依次用400 mL濃度為35%，55%，75%，85%，95%的乙酸乙酯石油醚（即料液比為1:2）進(jìn)行洗脫，每50 mL裝一瓶，從第一瓶開(kāi)始編號(hào)，依次為1,2,3,4,5······直到95%的洗脫液不再

40、下滴。</p><p>　　檢測(cè)：將得到的固體物質(zhì)用無(wú)水乙醇定溶至25 mL，依次用HPLC進(jìn)行測(cè)定，記錄數(shù)據(jù)。</p><p>　　2.4提取條件的的確定</p><p>　　2.4.1提取方法對(duì)黃酮類化合物提取率的影響</p><p>　　稱取3份15 g陳皮粉末，150 mL無(wú)水乙醇(即料液比為1：10)，分別用索式提取法，加熱回流法，

41、靜置提取法提取，分別對(duì)提取液進(jìn)行抽濾，并分別用30 mL原濃度的乙醇水溶液洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，萃取，再蒸干，稱量固體物質(zhì)量。</p><p>　　2.4.2乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響</p><p>　　稱取5份25 g陳皮粉末，分別加入250 mL濃度為20％、40％、60%、80％、100％的乙醇水溶液(即料液比為1：10)，靜置提取24 h。分別對(duì)提

42、取液進(jìn)行抽濾，并分別用50 mL原濃度的乙醇水溶液洗滌濾渣，合并濾液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，萃取，再蒸干，稱量固體物質(zhì)量。</p><p>　　2.4.3提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響</p><p>　　稱取5份50 g陳皮粉末，分別加入500 mL無(wú)水乙醇(即料液比為l：10)，分別靜置提取1 d，2 d，3 d，4 d，5 d。分別對(duì)提取液進(jìn)行抽濾，并分別用100 mL乙醇洗

43、滌濾渣，合并濾液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，萃取，再蒸干，稱量固體物質(zhì)量。</p><p>　　2.5川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線</p><p>　　稱取20 mg川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇定容至50 mL容量瓶中，配置成0.4 mg/mL，記為A溶液。分別取A溶液5 mL，10 mL，12.5 mL，12.5 mL定容至50 mL，50 mL，50 mL，25 mL，濃度即為0.04 m

44、g/mL，0.08 mg/mL，0.10 mg/mL，0.20 mg/mL，用HPLC進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)定五組標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收峰面積的線性關(guān)系。</p><p><b>　　3結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1提取條件的探究</p><p>　　3.1.1提取方法對(duì)黃酮類化合物提取率結(jié)果與分析</p><p>　　

45、本文研究不同方法提取方法對(duì)黃酮類化合物提取率的影響，其中靜置提取法提取出0.2789 g，加熱回流提取法提取出0.2978 g，索式提取法提取出0.3214 g。由數(shù)據(jù)可知索氏提取法提取的量是最大的，可是考慮到實(shí)際情況，索氏提取法和加熱回流法都只能少量提取，但靜置提取法可以大批量的提取，運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)，且索氏提取法和加熱回流法相對(duì)靜置提取法來(lái)說(shuō)消耗的能源較多且存在安全隱患，再就是靜置提取法的產(chǎn)量相對(duì)前兩者差距不是太大，所以最終決定采用靜

46、置提取法提取。</p><p>　　3.1.2乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物提取率結(jié)果與分析</p><p>　　采用20％、40％、60％、80％、100％的乙醇水溶液對(duì)枳實(shí)中的黃酮苷類化合物進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，研究提取液濃度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。</p><p>　　圖2乙醇濃度對(duì)黃酮類化合物提取率的影響</p><p>　　Fig.2

47、Effect of alcoholconcentration on flavonoid glycosides extraction rate</p><p>　　由圖可知，20%與40%提取液提取出的量差別不大，而40%到100%提取液的提取率變化較大，且依次遞增，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組中提取出的質(zhì)量依次為0.0194 g，0.0097 g，0.0798 g，0.3574 g，0.4982 g，所以提取液濃度應(yīng)當(dāng)以100%為

48、最佳。</p><p>　　3.1.3提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率結(jié)果與分析</p><p>　　不同提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響見(jiàn)圖3。</p><p>　　圖3提取時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響</p><p>　　Fig.3Effect of extraction time on flavonoid glycosides extr

49、action rate</p><p>　　由圖可知，在5個(gè)試驗(yàn)組中，浸提5 d提取率最大，為0.60 g，此前1 d到4 d的分別提取出是0.42 g，0.44 g，0.39 g，0.47 g，總體變化趨勢(shì)不大。因?yàn)榻? d到4 d的產(chǎn)量變化不大，只有5 d的突然加大到0.60 g，考慮到實(shí)際操作的效率問(wèn)題，最后選擇提取時(shí)間為1 d。</p><p>　　3.2川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲

50、線</p><p>　　將配制好的0.04 mg/mL，0.08 mg/mL，0.10 mg/mL，0.20 mg/mL，0.40 mg/mL的川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品做檢測(cè)，結(jié)果如表1，圖4.</p><p>　　表1川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　Table.1 Standard test results of the nobiletin</p>

51、<p>　　圖4川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線</p><p>　　Fig.4 Nobiletin standard working curve</p><p>　　由圖可以看出，川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的曲線成線性關(guān)系，且經(jīng)計(jì)算得線性方程為Y=636.15X-0.8764，Y為峰面積，X為川陳皮素濃度。</p><p>　　3.3HPLC檢測(cè)結(jié)果分析</p>

52、<p>　　用5種不同濃度的洗脫劑（乙酸乙酯與石油醚組成）洗脫之后，得到結(jié)果如圖</p><p><b>　　5。</b></p><p>　　圖5洗脫劑洗脫之后所得樣品</p><p>　　Fig.5 After the eluent resulting sample</p><p>　　一共得到37組溶

53、液，由洗脫過(guò)程中得到的溶液的顏色判斷1,2,3組為裝柱時(shí)留下的石油醚，所以不進(jìn)行后期的討論，4-10是濃度為35%的洗脫劑洗脫所得溶液，11-17是濃度為55%的洗脫劑洗脫所得溶液，18-24時(shí)濃度為75%的洗脫劑洗脫所得溶液，25-31是濃度為85%的洗脫劑洗脫所得溶液，32-37是濃度為95%的洗脫劑洗脫所得溶液。所得溶液較理論值少了3瓶，可能原因有兩點(diǎn)，一是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的一些實(shí)際操作問(wèn)題，各方面都不是太準(zhǔn)確造成；二是因?yàn)橄疵摃r(shí)間較長(zhǎng)

54、，而洗脫劑的揮發(fā)性本來(lái)就很好，洗脫過(guò)程又是在通風(fēng)櫥中進(jìn)行的，所以導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中就揮發(fā)掉一部分。</p><p>　　HPLC檢測(cè)結(jié)果中，35%洗脫劑洗脫之后主要得到四種物質(zhì)，取其中8號(hào)圖，如圖6.</p><p>　　圖6編號(hào)35%-8號(hào)的檢測(cè)圖</p><p>　　Fig.6Detection results of No.35%-8</p><

55、;p>　　由圖譜可知，該組分中保留時(shí)間在13 min以后的化合物含量很高，說(shuō)明35％的洗脫液將極性小的物質(zhì)分離出來(lái)。由前面對(duì)川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果可以知道，川陳皮素的保留時(shí)間在11.5 min左右，所以此溶液中的物質(zhì)都是副產(chǎn)物，但由現(xiàn)有的黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品可以確定保留時(shí)間為13.625 min的物質(zhì)為橘皮素，所以還要加大洗脫劑極性，使保留時(shí)間較短的物質(zhì)洗脫出來(lái)。</p><p>　　用55%的洗脫劑洗脫之

56、后主要得到兩種物質(zhì)，如圖7.</p><p>　　圖7編號(hào)55%-15號(hào)的檢測(cè)圖</p><p>　　Fig.7Detection results of No.55%-15</p><p>　　由圖可知，保留時(shí)間為13.675 min的物質(zhì)在35%的洗脫液中也有出現(xiàn)，確定為橘皮素；保留時(shí)間為12.670 min的物質(zhì)是新洗脫下來(lái)的一種物質(zhì)，經(jīng)對(duì)比黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品圖

57、譜確認(rèn)為3,5,6,7,8,3’,4’——七甲氧基黃酮。本圖還可明顯看出，55%的洗脫劑幾乎不能將川陳皮素洗脫下來(lái)，川陳皮素含量?jī)H為0.48%，所以還要加大洗脫劑極性。</p><p>　　用75%的洗脫劑洗脫下來(lái)的結(jié)果如圖8，圖9，圖10，圖11.</p><p>　　圖8編號(hào)75%-18號(hào)的檢測(cè)圖</p><p>　　Fig.8Detection results

58、 of No.75%-18</p><p>　　圖9編號(hào)75%-20號(hào)的檢測(cè)圖</p><p>　　Fig.9Detection results of No.75%-20</p><p>　　圖10編號(hào)75%-21號(hào)的檢測(cè)圖</p><p>　　Fig.10Detection results of No.75%-21</p>&

59、lt;p>　　圖11編號(hào)75%-24號(hào)的檢測(cè)圖</p><p>　　Fig.11Detection results of No.75%-24</p><p>　　由圖3-6（即18號(hào)樣品）可知，75%的洗脫液中還有橘皮素和3,5,6,7,8,3’,4’——七甲氧基黃酮，但川陳皮素也開(kāi)始被洗脫下來(lái)；由圖3-7（即20號(hào)樣品）可以看出，溶液中幾乎只有川陳皮素一種物質(zhì)峰，純度已經(jīng)達(dá)到了99

60、.70%，且保留時(shí)間大于11 min的物質(zhì)全部被洗脫下來(lái)，保留時(shí)間小于11 min的物質(zhì)開(kāi)始顯現(xiàn)；由圖3-8可以看出，保留時(shí)間小于11 min的物質(zhì)已經(jīng)出峰，保留時(shí)間為9.098 min，對(duì)比黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜可知該物質(zhì)為4,5,6,7,3’,4’——六甲氧基黃酮；由圖3-9可知，川陳皮素的峰面積只有2.659 mAU*min，所以川陳皮素幾乎已全部被洗脫下來(lái)。</p><p>　　用85%的洗脫劑洗脫下來(lái)

61、的結(jié)果如圖12.</p><p>　　圖12編號(hào)85%-25號(hào)的檢測(cè)圖</p><p>　　Fig.12Detection results of No.85%-25</p><p>　　由圖不難看出，有幾種物質(zhì)峰，但量都不大，且有一種極性更大的物質(zhì)被洗脫下來(lái)，基本可以說(shuō)明極性稍小的幾種黃酮類化合物都已經(jīng)被洗脫下來(lái)，所以可以確定我們所需的川陳皮素已經(jīng)被分離出來(lái)。<

62、;/p><p><b>　　4結(jié)果與討論</b></p><p>　　在黃酮類化合物提取工藝中，由于考慮到實(shí)際情況的因素，決定采用乙醇浸泡提取法提取，浸泡時(shí)間以1 d為最好。將所有檢測(cè)結(jié)果中川陳皮素的峰面積相加約為2430 mAU*min，由Y=636.15X-0.8764（Y為峰面積，X為川陳皮素濃度）可得X=3.86 mg/mL，經(jīng)計(jì)算得每克黃酮類化合物中含有59.7

63、 mg川陳皮素。</p><p>　　分析分離結(jié)果可得，先用35%和55%的濃度的洗脫劑洗脫，可將黃酮類化合物粗提取物中的極性較小的物質(zhì)先洗脫下來(lái)，后面能得到單品做鋪墊；用75%濃度的洗脫劑洗脫得到的圖譜中可以確定，在某個(gè)時(shí)間段內(nèi)，可以得到川陳皮素的單品，所以可在這個(gè)濃度段內(nèi)更細(xì)化的檢測(cè)，從而確保得到單一的川陳皮素；用85%和95%濃度的洗脫液洗脫得到的基本就不是川陳皮素了，其余也都是副產(chǎn)物。</p>

64、<p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 176．</p><p>　　石力夫，梁華清．黃皮橘果皮化學(xué)成分的分離和鑒定[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993, l4 (3):249-251.</p><p>　　武井．應(yīng)用毛細(xì)

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74、導(dǎo)，正是由</p><p>　　于兩位老師的熱情慷慨以及多方面提供寶貴的意見(jiàn)和建議，才使得我的論文得以</p><p>　　順利完成，在此表示由衷的感謝。在實(shí)驗(yàn)期間，李維，曹聰，呂小健等同學(xué)也給了我無(wú)私而熱情的幫助，在此向他們深表謝意。</p><p>　　通過(guò)論文的設(shè)計(jì)，制作，使我學(xué)到了很多以前不知道的東西，也使我的實(shí)驗(yàn)操作能力得到了很大的提升。實(shí)驗(yàn)中鞏固了以前的