海帶提取物對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌作用研究.pdf

1、馬鈴薯環(huán)腐病是嚴重危害馬鈴薯的病害之一,目前已經遍及了幾乎所有的馬鈴薯產區(qū)。引起馬鈴薯環(huán)腐病的病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種(Clavibater michiganense subsp. sepedonicum(Spieckermann & Kotthoff)Davis et al.)。當前,人們主要利用化學殺菌劑對此病進行藥物防治。由于化學殺菌劑本身固有的缺點,使其產生了環(huán)境污染、人畜中毒和農藥殘留等問題。植物在天然環(huán)境中可以形成大量

2、的次生代謝產物來抵御植物病原菌。因此,以植物為材料的植物源殺菌劑受到了科研工作者們的廣泛關注。然而,目前仍然沒有有效抑制密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的植物源殺菌劑出現(xiàn)。本文以海帶為主要材料研究其對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌作用,主要的研究內容和結果如下:
　　1.抑菌植物的篩選和海帶抑菌物質提取工藝的優(yōu)化
　　30種植物的抑菌實驗結果表明海帶提取物相對于其他植物提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。通過八種溶劑的篩

3、選,得到乙醇為海帶抑菌物質提取的有效溶劑。分別進行提取溫度、提取時間和提取比例三個因素的單因素實驗。由單因素實驗結果得出了正交實驗因素的水平為,提取溫度70°C、80°C、90°C;提取時間8h、10h、12h;提取比例1:20、1:25、1:30。正交實驗的結果表明提取溫度、提取溫度與提取時間的交互作用顯著(P<0.05)地影響海帶乙醇提取物對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌效果。海帶抑菌物質的優(yōu)化提取工藝為提取溫度80°C、提取時間12

4、h、提取比例1:25(g:mL)。
　　2.海帶乙醇提取物的性質測定
　　海帶乙醇提取物對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的最低抑菌濃度為0.38mg/mL,最低殺菌濃度為0.75mg/mL。穩(wěn)定性實驗結果表明:在pH為5時,海帶乙醇提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。提取物在紫外光下的抑菌活性穩(wěn)定。Mn2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+可增強提取物的抑菌活性,Ca2+可降低提取物的抑菌活性。
　　3.海帶抑菌成

5、分的活性追蹤和分析
　　萃取實驗結果表明,海帶乙醇提取液的石油醚萃取物對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種有最強且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。根據薄層層析(TLC)對海帶石油醚萃取物的分離結果,得出石油醚/乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)為柱層析的洗脫液。海帶石油醚萃取物經過一級柱層析分離后,共得到19個流份。抑菌結果表明這19個流份均對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種有抑菌效果,其中流份3(Fr.3)與其他流份及石油醚萃取物相比,抑菌效果最好且有顯著性差異(

6、P<0.05)。二級柱層析結果表明,各次級流份的抑菌效果均顯著(P<0.05)低于 Fr.3的抑菌效果。因此對一級柱層析中分離得到抑菌效果最好的Fr.3進行進一步的氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)分析。結果得出Fr.3共計確認出了26種化合物,可以分為6類,其中包括11種烷烴類化合物、5種酯類化合物、5種有機酸類化合物、3種醇類化合物、1種酚類化合物和1種酸酐類化合物。所有組分中相對含量較高(4％)的有9種化合物,分別為:二十五烷(11

7、.97%)、二十七烷(10.71%)、三十四烷(10.22%)、三十一烷(10.07%)、二十九烷(9.68%)、二十八烷(7.57%)、三十六烷(7.32%)、四十四烷(5.88%)和二十二烷(4.04%)。
　　4.海帶抑菌成分作用機理的研究
　　設計了生長曲線測定實驗、掃描電子顯微鏡(SEM)觀察實驗、透射電子顯微鏡(TEM)觀察實驗、細胞壁和細胞膜透性實驗、菌體內活性氧(ROS)水平,超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化

8、氫酶(CAT)活性測定實驗、呼吸代謝影響實驗、SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳實驗、核酸影響實驗。通過這八類實驗對Fr.3作用于密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌機理進行了探討。生長曲線的實驗結果表明Fr.3主要作用于密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的對數(shù)期,通過抑制菌體的正常分裂來抑制菌體生長。采用掃描電鏡和透射電鏡觀察密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的超微結構,Fr.3作用后的密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種細胞壁損壞、細胞膜破損、細胞出現(xiàn)了腫脹、結團、

9、質壁分離的現(xiàn)象,菌體內部出現(xiàn)了大小不一的空腔,一些受破壞嚴重的菌體被裂解成片狀。分別檢測菌體外堿性磷酸酶(AKP)活性和OD260nm值得出Fr.3對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的細胞壁和細胞膜有破壞作用。流式細胞儀和熒光顯微鏡的檢測結果表明Fr.3作用后的菌體,細胞膜出現(xiàn)了嚴重的去極化現(xiàn)象,菌體內Ca2+濃度有所上升。這個結果也證明了Fr.3作用下的密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的細胞膜受到了破壞。熒光分光光度計和紫外分光光度計的檢測結果得出Fr.

10、3能夠使菌體內ROS顯著性地積累、SOD和CAT活性降低。通過進行培養(yǎng)基溶氧測定實驗、呼吸抑制率及疊加率測定實驗、細胞內己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和總ATP酶(T-ATPase)活性測定實驗,得出Fr.3通過抑制LDH、MDH和SDH活性來抑制糖酵解(EMP)途徑和三羧酸(TCA)循環(huán),使得呼吸作用減弱。SDS-PAGE的結果顯示,Fr.3作用后菌體的總蛋白

11、量不斷減少。熒光分光光度計檢測結果得出 Fr.3能夠明顯地減少菌體內DNA和RNA的含量。瓊脂糖凝膠電泳實驗結果表明Fr.3可以直接作用于密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的基因組DNA。Fr.3作用后,基因組 DNA的紫外光譜發(fā)生了明顯的增色效應,說明由于Fr.3的作用,導致了DNA雙螺旋的結構受到了破壞。Fr.3和溴化乙錠(EB)與基因組DNA的競爭性實驗結果表明,Fr.3和EB競爭性地插入到 DNA雙螺旋的堿基對中,使得 EB-DNA復合物的

12、數(shù)量減少。流式細胞儀的分析結果表明由于 Fr.3的作用,使得密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種正常的細胞分裂周期發(fā)生了紊亂,細菌數(shù)目減少?？傊?Fr.3中的抑菌物質通過不同位點的協(xié)同作用最終導致密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的死亡。
　　5.海帶乳油的配制和活體抑菌效果
　　海帶乳油的配方為:提取物浸膏(20%)、乙醇(10%)、吐溫-80(4%)及水(66%)。海帶乳油具有良好的穩(wěn)定性和分散性?；铙w實驗結果表明,海帶乳油有較好的預防效果和治療

13、效果,說明海帶乳油可以很好地防治密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種對馬鈴薯的侵染。
　　6.其他植物對密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種的抑菌效果
　　在所篩選的30種植物中,紅蓼提取物和中華蹄蓋蕨提取物的抑菌效果雖然略低于海帶,卻顯著性(P<0.05)地高于其他植物提取物的抑菌效果。以紅蓼和中華蹄蓋蕨作為殺菌植物資源抑制密執(zhí)安棒形桿菌環(huán)腐亞種,國內外尚未有報道。本文對紅蓼葉和中華蹄蓋蕨抑菌物質的提取工藝進行了優(yōu)化,紅蓼葉抑菌物質的優(yōu)化提取工藝為提

14、取時間6h、提取溫度80°C、提取比例1:10(g:mL)。中華蹄蓋蕨抑菌物質的優(yōu)化提取工藝為提取比例1:20(g:mL)、提取溫度97°C、提取時間10h。穩(wěn)定性實驗結果表明,在pH為5時,紅蓼葉乙醇提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。在pH為2時,中華蹄蓋蕨乙醇提取物具有最好且差異顯著(P<0.05)的抑菌效果。紅蓼葉和中華蹄蓋蕨乙醇提取物在紫外光下的抑菌效果穩(wěn)定。Zn2+、Fe3+可以增強紅蓼葉和中華蹄蓋蕨乙醇提取