費(fèi)菜提取液抑菌效果和抗氧化研究【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　費(fèi)菜提取液抑菌效果和抗氧化研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品質(zhì)量與安

2、全 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></

3、p><p>　　1引言錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　2材料與方法4</b></p><p>　　2.1 材料與試劑4</p><p>　　2.1.1 原料5</p><p>　　2.1.2 試驗(yàn)菌種5</p><p>　　2.1.3 試劑2<

4、/p><p>　　2.1.4 主要儀器2</p><p>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法6</p><p>　　2.2.1實(shí)驗(yàn)路線6</p><p>　　2.2.2 測(cè)定方法3</p><p>　　2.2.2.1 費(fèi)菜提取液中黃酮濃度測(cè)定3</p><p>　　2.2.2.2 菌種的預(yù)處理錯(cuò)誤!未

5、定義書簽。</p><p>　　2.2.2.3 費(fèi)菜提取液抑菌圈測(cè)定4</p><p>　　2.2.2.4 費(fèi)菜提取液最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定5</p><p>　　2.2.2.5 費(fèi)菜提取液最低殺菌濃度（MB）測(cè)定5</p><p>　　2.2.2.6 費(fèi)菜提取液還原力測(cè)定5</p><p>　　2.2.2

6、.7 費(fèi)菜提取液羥自由基清除率測(cè)定5</p><p>　　2.2.2.8 費(fèi)菜提取液DPPH·清除能力測(cè)定6</p><p><b>　　3結(jié)果與分析6</b></p><p>　　3.1 費(fèi)菜提取液總黃酮含量6</p><p>　　3.2 費(fèi)菜提取液的抑菌效果7</p><p&g

7、t;　　3.3不同濃度的費(fèi)菜提取液對(duì)細(xì)菌的抑制效果9</p><p>　　3.4 不同濃度的費(fèi)菜提取液的滅菌效果9</p><p>　　3.5 費(fèi)菜提取液的還原能力10</p><p>　　3.6 費(fèi)菜提取液清除羥基自由基的能力10</p><p>　　3.7 費(fèi)菜提取液清除DPPH·的能力11</p>&l

8、t;p><b>　　4小結(jié)12</b></p><p>　　4.1 費(fèi)菜提取液的抑菌效果12</p><p>　　4.2 費(fèi)菜提取液的抗氧化效果12</p><p><b>　　致謝13</b></p><p>　　參考文獻(xiàn)錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p>

9、<b>　　附錄15</b></p><p>　　【摘要】 費(fèi)菜，俗稱養(yǎng)心草、救心菜、三七等，屬景天科多年生草本植物。費(fèi)菜是一種集食用、藥用和觀賞為一體的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物。本文通過(guò)測(cè)定抑菌圈、MIC、MBC等方法對(duì)費(fèi)菜提取液進(jìn)行抑菌效果研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌效果，而且抑菌效果隨著費(fèi)菜提取液濃度的增加而加強(qiáng)；用還原力、羥自由基清除率和DPPH自由基清除

10、率測(cè)定抗氧化能力表明具有較強(qiáng)的抗氧化能力。通過(guò)此研究可以提高費(fèi)菜有效成分的應(yīng)用新價(jià)值，有助于生產(chǎn)天然保健品和出具有治療和預(yù)防多種疾病的藥品，為費(fèi)菜的綜合利用開(kāi)辟新途徑，創(chuàng)造更大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 費(fèi)菜; 抑菌; 抗氧化</p><p>　　【Abstract】 Aizoon stonecrop herb, commonly known as yangx

11、in grass, save heart grass, notoginseng etc.It is belong to Stonecrop Herb perennial herbaceous plants.Aizoon Stonecrop Herb is an economic crops aggregate edible、medicinal and ornamental functions, This article uses det

12、ermination bacteriostatic circle, MIC, MBC methods to research the bacteriostatic effect of Aizoon Stonecrop Herb extract. Founding that its has obvious bacteriostatic effect to escherichia coli, staphylococcus aureus an

13、d </p><p>　　【Keyword】 Aizoon stonecrop herb; bacteriostat; antioxidati</p><p><b>　　1.引言</b></p><p>　　費(fèi)菜，俗稱養(yǎng)心草、救心菜、三七、土三七等，屬景天科多年生草本植物。株高25—50厘米，叢生，分蘗力強(qiáng)。肉質(zhì)根較肥大，葉匙形，對(duì)生，翠

14、綠，肥厚多汁，葉緣鋸齒狀；花黃色，星蕓狀集生頂部，成片狀分布，花期6—9月；果熟期8—10月，種子細(xì)小。</p><p>　　費(fèi)菜始載于《救荒本草》，具體很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，據(jù)研究測(cè)定[1]，每l00g鮮食部位含蛋白質(zhì)2lg、碳水化臺(tái)物8g、脂肪0.7g．粗纖維1.5g、胡蘿卜素2.8mg、維生素B．0.05mg、維生素B 0.3lmg，維生素C 95mg、煙酸0.9mg，鈣315mg，磷39mg、鐵32mg。除了營(yíng)

15、養(yǎng)方面的價(jià)值，費(fèi)菜還有不菲的藥用價(jià)值，它含有生物堿、谷甾醇、黃酮類、齊敦果酸、景天庚糖，果糖等藥物成分。費(fèi)菜中的生物堿具有抗腫瘤活性，保護(hù)心血管系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)痛和止痛作用，還具有抑菌效果[2]；谷甾醇能阻止人體對(duì)膽固醇的吸收，降血脂，防止血管硬化；黃酮類可擴(kuò)張心腦血管，促進(jìn)血液循環(huán)；齊墩果酸還可保護(hù)肝臟，起到延緩老年性肝組織纖維化的作用，經(jīng)常服用能有益健康、延年益壽[3]。</p><p>　　費(fèi)菜幾乎無(wú)

16、病蟲(chóng)危害，栽培過(guò)程不施農(nóng)藥，無(wú)污染，無(wú)農(nóng)藥殘留，是一種綠色食品，受到廣大人們的喜愛(ài)。費(fèi)菜主要食用嫩莖葉，無(wú)異味。采下洗凈可直接素炒，配肉、蛋、食用菌炒，火鍋、燉食、清蒸、澆湯，久煮不爛[4]。 費(fèi)菜藥用功能主要有消腫、定痛、止血、化瘀、治吐血、衄血、便血、尿血、崩漏、乳癰、跌打損傷等，也是治療心臟病的良藥。</p><p>　　費(fèi)菜具有群體整齊，顏色鮮綠，覆蓋率高，花色鮮艷，花期較長(zhǎng)的特點(diǎn)。費(fèi)菜在栽培過(guò)程中不生蟲(chóng)

17、、無(wú)病害，這是它的一大優(yōu)點(diǎn)，能在貧瘠的土壤里長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯，所以無(wú)需噴灑農(nóng)藥，避免了化肥污染；加之其易種、易管、產(chǎn)量高，一般栽培條件下，每667m2產(chǎn)量可達(dá)5000kg以上，所以是園林花壇、草坪綠化難得的好品種，又是農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和發(fā)展無(wú)公害綠色蔬菜的理想品種之一。家庭栽培幾盆費(fèi)菜，既有藥用價(jià)值，又能美化環(huán)境，凈化空氣，陶冶情操，增添樂(lè)趣[5]。</p><p>　　費(fèi)菜經(jīng)萎凋脫水15％ ～20％ ，搖青3～5分鐘，

18、渥堆6小時(shí)，220～240oC殺青5～6分鐘、揉捻、烘干可制得色香味俱佳的方便飲品養(yǎng)心茶[6]，泡出的茶水色、香、味俱佳，飲用后可高效抑制失眠、心悸、煩悶等癥，加糖飲用1：3味更佳；除降血壓外，還可解除酒醉頭痛。除主治心腦血管疾病外，而且對(duì)吐血、咯血、煩躁失眠、驚悸癔癥、跌打損傷有療效。</p><p>　　目前已有很多研究，從不同植物中提取黃酮和生物堿開(kāi)發(fā)不同的產(chǎn)品[7-8]。比如竹葉黃酮飲料、啤酒、保健膠囊、

19、抗氧化劑、美容護(hù)膚品；銀杏黃酮飲料、啤酒、保健膠囊、美容護(hù)膚品；大豆異黃酮膠囊；生物堿的鎮(zhèn)咳止痛抗腫瘤等。費(fèi)菜含有大量的黃酮類和生物堿，目前對(duì)費(fèi)菜的研究基本還停留在其藥用價(jià)值、培養(yǎng)和繁殖階段，沒(méi)有對(duì)費(fèi)菜進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)，今后費(fèi)菜的研究方向可以轉(zhuǎn)向費(fèi)菜的生物活性成份。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料與儀器

20、</b></p><p><b>　　2.1.1材料</b></p><p>　　原料：費(fèi)菜，產(chǎn)于寧波慈溪。</p><p>　　試驗(yàn)菌種：大腸桿菌(Escherichia coli)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）</p><p&

21、gt;<b>　　2.1.2 試劑</b></p><p><b>　　無(wú)水乙醇：</b></p><p>　　蘆丁(蕓香葉苷）：BR，含量≥95%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；</p><p>　　亞硝酸鈉: 分析純，宜興市第二化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；</p><p>　　硝酸鋁： 分析純，天津市永大化

22、學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；</p><p>　　氫氧化鈉：分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司；</p><p>　　三氯乙酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；</p><p>　　鐵氰化鉀：分析純，北京化工廠；</p><p>　　三氯化鐵：分析純，宜興市第二化學(xué)試劑廠；</p><p>　　磷酸二氫鈉：分析純，汕頭全砂化工廠；

23、</p><p>　　磷酸氫二鈉：分析純，天津市巨星圣源化學(xué)試劑有限公司；</p><p>　　硫酸亞鐵：分析純，上海展云化工有限公司；</p><p>　　抗壞血酸（VC）：分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司；</p><p>　　水楊酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；</p><p>　　冰醋酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)

24、試劑有限公司；</p><p>　　無(wú)水醋酸鈉：分析純，上海試劑四廠；</p><p>　　雙氧水、鹽酸、無(wú)水乙醇（均為國(guó)產(chǎn)分析純）；蒸餾水。</p><p>　　細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：BR，成分為蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20g，取38g加蒸餾水至1000mL，pH 7.2~7.4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；</p><p>

25、;　　LB肉湯：BR，成份為蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉5g，葡萄糖1g，取21加蒸餾水至1000mL，中國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所。</p><p>　　2.1.3 主要儀器</p><p>　　電熱恒溫水浴鍋：DK-S22型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；</p><p>　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：SENCO R-201型，上海申順生物科技有限公司；</p>

26、<p>　　循環(huán)水真空泵：SHZ-D(Ш)型，鞏義市英峪予華儀器廠；</p><p><b>　　濕熱滅菌鍋：</b></p><p>　　電熱鼓風(fēng)干燥箱：CS101-1AB型，中國(guó)重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；</p><p>　　酸度計(jì)：pHS-25型，上海理達(dá)儀器廠；</p><p>　　可見(jiàn)分光光度計(jì)：

27、7200型，尤尼柯（上海）儀器有限公司；</p><p>　　高速臺(tái)式離心機(jī)：H1650型，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；</p><p>　　電子天平：BP221D型，Sartorius。</p><p>　　氣浴恒溫振蕩器：SHZ-82型，金壇市科析儀器有限公司；</p><p><b>　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法</b>&

28、lt;/p><p><b>　　2.2.1實(shí)驗(yàn)路線</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)主要分為三部分，原料準(zhǔn)備、抑菌能力和抗氧化能力測(cè)定。</p><p>　　原料準(zhǔn)備包括原料的預(yù)處理和費(fèi)菜提取液粗提取。原料預(yù)處理：取新鮮費(fèi)菜葉在70℃烘干24h，然后用藥物粉碎機(jī)粉粉碎并過(guò)80目篩，得到的葉粉備用，在提取之前將葉粉在105℃烘干2h左右。費(fèi)菜提取液粗

29、提取過(guò)程[9-10]：稱取5g干粉，置于500ml錐形瓶中，按照料液比1:50加入濃度為90%的乙醇，超聲提取50min，60℃水浴浸提6h，趁熱抽濾，得到濾液。將粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45-50℃下濃縮至適量后，加入2倍體積的95％乙醇以沉淀多糖，放入冰箱6h，過(guò)濾，再將提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45-50℃下濃縮至適量后待用。</p><p>　　抑菌能力測(cè)定包括費(fèi)菜提取液中黃酮濃度、抑菌圈大小、MIC（最低抑菌濃度）

30、和MBC（最低殺菌濃度）的測(cè)定。</p><p>　　抗氧化能力測(cè)定包括費(fèi)菜提取液還原力、費(fèi)菜提取液羥自由基清除率和費(fèi)菜提取液DPPH﹒清除能力的測(cè)定。</p><p><b>　　2.2.2測(cè)定方法</b></p><p>　　2.2.2.1 費(fèi)菜提取液中總黃酮濃度測(cè)定</p><p>　　標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備[11-12]

31、。精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁9.0mg，置50mL量瓶中，加30%乙醇適量，置水浴上微熱使其溶解、冷卻，加30%乙醇至刻度，搖勻，量取上述試液10.0mL，置100mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。每1mL含蘆丁0.018mg。</p><p>　　精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL，分置25mL量瓶中，各加水至6mL；分別加5 %Na

32、NO2溶液1mL，搖勻，放置6min；分別加10 %Al(N03)3溶液1mL，搖勻，放置6min；然后分別加4 %NaOH溶液10mL，并分別加水至刻度，搖勻，靜置15min，在510nm測(cè)定吸收度，以30%乙醇溶液代替蘆丁溶液做空白對(duì)照。以濃度(C)(mg/mL)對(duì)吸光度(A)作標(biāo)準(zhǔn)曲線.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1得到回歸方程y=12.353x-0.0022，R2=0.9997。</p><p><

33、b>　　圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線</b></p><p>　　Fig.1 The standard curve of Rutin</p><p>　　費(fèi)菜提取液中總黃酮含量測(cè)定。把制得的費(fèi)菜提取液取1ml稀釋100倍，分別吸取0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml稀釋液代替蘆丁溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測(cè)吸光值。</p><p>

34、;　　2.2.2.2 菌種的預(yù)處理[13]</p><p>　　首先制作九管無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，并標(biāo)記好菌種和時(shí)間，第一天用三管斜面分別接種三種細(xì)菌，在37oC培養(yǎng)24h；第二天以培養(yǎng)好的細(xì)菌為菌種，分別接種一管，繼續(xù)在在37oC培養(yǎng)24h；第三天以第二天培養(yǎng)的細(xì)菌為菌種，分別接種一管，在在37oC培養(yǎng)24h，備用。</p><p>　　在無(wú)菌條件下，取一環(huán)大腸桿菌放入0.9%的無(wú)菌

35、生理鹽水中，充分震蕩混勻后，制成10-1的均勻稀釋液。大概使菌懸液的濃度為106、107cfu/ml（之前做幾次預(yù)實(shí)驗(yàn)）。領(lǐng)取5支9ml無(wú)菌生理鹽水試管，分別標(biāo)記大腸桿菌和10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。用1ml滅菌移液槍吸取10-1稀釋菌液1ml，沿著管壁徐徐注入標(biāo)有10-2試管的滅菌生理鹽水中（注意移液槍頭不要觸及管內(nèi)稀釋液），然后另?yè)Q1個(gè)1ml移液槍頭插入10-2試管中反復(fù)吹吸菌懸液10余次，充分混合均勻（吹吸菌

36、液時(shí)不要過(guò)猛太快，吸時(shí)將槍頭插入液面下面一點(diǎn)，吹時(shí)將吸管提到接近液面以下），制成10-2稀釋液。按上述操作順序，制成10-3、10-4、10-5、10-6系列稀釋菌液（每遞增稀釋一次，即換用一個(gè)槍頭，否則稀釋不準(zhǔn)）。</p><p>　　2.2.2.3 提取液的抑菌圈測(cè)定</p><p>　　先將滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基融化后，在無(wú)菌室中趁熱導(dǎo)入無(wú)菌平板中，冷卻后分別做好標(biāo)記。用移液槍取10-

37、6試管中的菌液0.1ml，對(duì)號(hào)接種于10-6的平板中（每個(gè)編號(hào)設(shè)兩個(gè)重復(fù)），再用無(wú)菌玻璃涂布棒（用酒精棉擦拭并灼燒滅菌）將菌液涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20-30min，使菌液滲入培養(yǎng)基內(nèi)。</p><p>　　按照上述方法制作 10-1、10-4、10-5菌液的平板，10-4、10-5菌液各兩個(gè)，10-1菌液6個(gè)平板。10-4、10-5、10-6菌液做菌落總數(shù)計(jì)數(shù)用，10-1菌液做抑菌圈用。</p>

38、<p>　　把直徑為6mm的打孔器（用酒精棉擦拭并在酒精燈上灼燒滅菌），在每個(gè)10-1菌液平板上打3個(gè)孔，每個(gè)孔之間相差30mm以上，并用無(wú)菌鑷子（酒精棉擦拭并在酒精燈上灼燒滅菌）把平板上打孔后的瓊脂拿掉。取出一個(gè)平板，分別在里面的三個(gè)孔中注入50μl的無(wú)菌水、硫酸慶大霉素溶液、費(fèi)菜提取液，做3個(gè)平行。取出另一個(gè)平板，分別在里面的三個(gè)孔中注入50μl的費(fèi)菜提取液、0.1%山梨酸鉀、0.5%山梨酸鉀溶液，同樣做三個(gè)平行。以上操

39、作完后，菌落計(jì)數(shù)的幾個(gè)平板倒置于37oC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，做抑菌圈的幾個(gè)平板正放于37oC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察。</p><p>　　金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌也做以上相同的操作，但用山梨酸鉀做對(duì)照的只做大腸桿菌。</p><p>　　2.2.2.4 費(fèi)菜提取液最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定[14-15]</p><p>　　總黃酮采用二倍稀釋法配成各種濃度，

40、其方法：取6支試管分別加入2mL液體培養(yǎng)基，2mL提取液于第1支試管中，混勻后取2mL入第2管，然后依次取2mL移入下一管，到笫6管時(shí)棄去2mL，即將提取原液(1g/mL)用提取相應(yīng)的溶劑按照1：2、1：4、1：8、1：16、1：16、1：32的比例進(jìn)行倍半稀釋，得6個(gè)濃度的稀釋提取液。在這6管中分別加入0.1rnL大腸桿菌10-1菌液，另取7支試管不加菌液作為空白對(duì)照。將其放于培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h，觀察記錄澄清不長(zhǎng)菌的最高稀釋度

41、就是最低抑菌濃度(MIC)，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)平行組，結(jié)果以平均值計(jì)。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌也做以上相同的操作。</p><p>　　2.2.2.5 費(fèi)菜提取液最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定[16-17]</p><p>　　取若干個(gè)無(wú)菌平皿做好標(biāo)記，將MIC測(cè)定中未生長(zhǎng)細(xì)菌的肉湯用傾注平板法接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37oC培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，以仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的管內(nèi)的費(fèi)菜提取液的濃度，為最低

42、殺菌濃度。</p><p>　　2.2.2.6 費(fèi)菜提取液還原力測(cè)定</p><p>　　原理[18]：抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在十分密切的關(guān)系?？寡趸瘎┦请娮拥慕o予體(elec—tron donor)，通過(guò)自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。因此，可通過(guò)測(cè)定還原力來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性的大小。普魯士藍(lán)法測(cè)定還原力的原理是樣品將鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6）

43、還原成亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)，亞鐵氰化鉀再與Fe3+作用，生成亞鐵氰化鐵(普魯士藍(lán))，在700nm波長(zhǎng)處檢測(cè)普魯士藍(lán)的吸光度，以表示還原力的大小，吸光度越高樣品的還原力就越強(qiáng)。</p><p>　　操作步驟[19]：在2.5 ml、pH 6.6磷酸緩沖溶液(phosphate bufer saline，PBS，pH 6.6)中加入1ml不同濃度的費(fèi)菜提取物溶液、1ml 1%鐵氰化鉀，混合物在50℃恒溫條

44、件下加熱20min，急速冷卻，加2.5 ml10%三氯乙酸，離心分離10min。取上層清液5ml，加5ml水，再加1ml 0.1%FeC13，混合均勻，靜置10min后，在700nm下測(cè)定其吸光度值(以蒸餾水代替樣品的混合液作參比溶液)，吸光度值越高還原力越強(qiáng)。</p><p>　　2.2.2.7 費(fèi)菜提取液羥自由基清除率測(cè)定</p><p>　　原理[20]：參照Fnton反應(yīng)的方法建立

45、反應(yīng)體系模型，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，但由于·OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在反應(yīng)體系中加入水楊酸，就能有效地捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。</p><p>　　反應(yīng)式如下： H2O2 + Fe2+ → Fe3+ +·0H + 0H-</p><p>　　該產(chǎn)物在510nm處有強(qiáng)吸收，若在此反應(yīng)體系中加入具有清除·OH功

46、能的被測(cè)物，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)·OH，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。</p><p>　　操作步驟[21]：于25mL容量瓶中依次加入2mmol/LFeSO4 5mL，6mmol/L H2O2 5mL，6mmol/L水楊酸一乙醇15mL，于37℃水浴中保溫15min后取出，以蒸餾水為參比，510nm下測(cè)其吸光度(Ao)，然后再加入1 mL被測(cè)定樣品，搖勻，37℃水浴中保溫15min后取出，以蒸餾水為參比，51

47、0nm下測(cè)其吸光度(Ax)?？紤]到色素本身的吸光度值，做了對(duì)照試驗(yàn)：于25mL容量瓶中依次加入2mmol/LFeSO45mL，蒸餾水5mL，6mmol/L水楊酸一乙醇15mL，于37℃水浴中保溫15min，然后加入1mL被測(cè)定樣品，搖勻，于37℃水浴中保溫15min后取出，以蒸餾水為參比，510nm下測(cè)其吸光度(Axo)。根據(jù)下面的公式計(jì)算抑制率。</p><p>　　清除率=[Ao-(Ax-Axo)]/Ao&#

48、215;l00％</p><p>　　式中：Ao為蒸餾水代替樣品的對(duì)照值；Ax為加樣后的吸光度；Axo為樣品本身的本底值。</p><p>　　把費(fèi)菜提取液稀釋10倍、8倍、6倍、4倍、2倍、1倍，分別測(cè)清除率，作圖。</p><p>　　2.2.2.8 費(fèi)菜提取液DPPH﹒的清除能力測(cè)定</p><p>　　原理[22]：DPPH·

49、;（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517nm處有最大吸收峰。當(dāng)有供氫的抗氧化劑存在時(shí)(如酚類)，孤電子被配對(duì)，DPPH·溶液的顏色變淺，吸光度值變小，根據(jù)吸光度的變化可測(cè)得抗氧化劑的活性。</p><p>　　操作步驟[23]：DPPH·以50%乙醇溶液配成0.2μmol/L溶液，取上述不同質(zhì)量濃度的待測(cè)液各2m1和DPPH·溶液2ml先

50、后加入同一具塞試管，搖勻于室溫下放置30min后，于517 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定各反應(yīng)液的吸光值。 </p><p>　　DPPH·的清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%</p><p>　　式中，Ai代表2mlDPPH·溶液加入2ml費(fèi)菜提取液吸光值，Aj代表2m1費(fèi)菜提取液加入2ml乙醇的吸光值，Ac代表2ml DPPH

51、83;溶液加入2ml乙醇的吸光值。</p><p>　　把費(fèi)菜提取液稀釋10倍、8倍、6倍、4倍、2倍、1倍，分別測(cè)清除率，作圖。</p><p><b>　　結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 費(fèi)菜提取液總黃酮含量</p><p>　　通過(guò)費(fèi)菜提取液中黃酮含量的測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表1所示。</p>

52、<p>　　表1 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果</p><p>　　Table 1 The flavonoids content determination result</p><p>　　費(fèi)菜提取液總黃酮的含量:2.382±0.011mg/ml</p><p>　　3.2費(fèi)菜提取液的抑菌效果</p><p>　　通過(guò)費(fèi)菜提

53、取液對(duì)細(xì)菌抑制效果的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表2、表3所示.</p><p>　　表2 菌懸液的細(xì)菌總數(shù)</p><p>　　Table 2 The total bacterial count of Bacteria levitation liquid</p><p>　　表3 費(fèi)菜提取液的抑菌效果</p><p>　　Table 3 Antimi

54、crobia effect of Aizoon Stonecrop Herb’extract</p><p>　　從表3可以看出，費(fèi)菜提取液對(duì)三種所選菌種的都有著明顯的抑制效果（見(jiàn)圖2-6）。其中對(duì)大腸桿菌的抑制效果尤為強(qiáng)烈，枯草芽孢桿菌次之，金黃色葡萄球菌最弱。從圖3和圖4可以得出，費(fèi)菜提取液對(duì)不同濃度的細(xì)菌抑制效果有所區(qū)別，細(xì)菌濃度越大，抑菌效果越弱。圖5和圖6的對(duì)照分別是0.1%和0.5%的山梨酸鉀溶液，從

55、圖可以看出費(fèi)菜提取液比山梨酸鉀的抑菌效果好。</p><p>　　費(fèi)菜提取液對(duì)幾種細(xì)菌的抑菌圈</p><p>　　Antimicrobial circles of Aizoon Stonecrop Herb extract against Some bacteria</p><p>　　圖1 107cfu/ml大腸桿菌 圖2 1

56、07cfu/ml金黃色葡萄球菌</p><p>　　Fig.1 107cfu/ml Escherichia coli Fig.2 107cfu/ml Staphylococcus aureus </p><p>　　圖3 107cfu/ml枯草芽孢桿菌 圖4 106cfu/ml枯草芽孢桿菌</p><p&g

57、t;　　Fig.3 107cfu/ml Bacillus subtilis Fig.4 106cfu/ml Bacillus subtilis </p><p>　　圖5 107cfu/ml大腸桿菌 （山梨酸鉀做對(duì)照） </p><p>　　Fig.5 107cfu/ml Escherichia coli （Potassium sorbet as

58、 compared）</p><p>　　3.3 不同濃度的費(fèi)菜提取液對(duì)細(xì)菌的抑制效果的影響</p><p>　　不同濃度費(fèi)菜提取液對(duì)上述三種受試菌的低抑制濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4</p><p>　　表4不同濃度山費(fèi)菜提取液對(duì)各種細(xì)菌的抑制效果</p><p>　　Table 4 Antimicrobial effect of Aizoon St

59、onecrop Herb’extract with different concentration on different Strains</p><p>　　注：+++表示液體非常渾濁，++表示液體渾濁，+表示液體輕微渾濁，- 表示液體澄清。</p><p>　　Note: +++ stands for liquid very turbidity. ++ stands for liqu

60、id turbidity. + stands for slight turbidity. - stands for liquid clarify. </p><p>　　在37oC溫箱中培養(yǎng)24h后，取出試管，肉眼觀察試管中液體的渾濁度，判斷細(xì)菌生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，費(fèi)菜提取液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都有明顯的抑制作用，隨著費(fèi)菜提取液濃度提高抑菌效果越強(qiáng)，到一定濃度后可以完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。三種菌

61、在費(fèi)菜提取液稀釋到1/16濃度時(shí)都出現(xiàn)渾濁，但金黃色葡萄球菌試管的液體更渾濁。所以三種菌的最低抑菌濃度是費(fèi)菜提取液稀釋到1/8的濃度。</p><p>　　3.4不同濃度的費(fèi)菜提取液的殺菌效果</p><p>　　不同濃度的費(fèi)菜提取液對(duì)上述三種受試菌的殺菌濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4</p><p>　　表5 費(fèi)菜提取液對(duì)各種細(xì)菌的最低滅菌濃度</p><

62、p>　　Table 5 Minimum bactericidal concentration of Aizoon Stonecrop Herb’extract on different Strains</p><p>　　注：+表示有菌體生長(zhǎng)，- 表示無(wú)菌生長(zhǎng)。</p><p>　　Note: + stands for biomass growth. - stands for no

63、 biomass growth. </p><p>　　在37oC溫箱中培養(yǎng)24h后，取出試管，肉眼觀察平板中是否長(zhǎng)有菌落，結(jié)果顯示，費(fèi)菜提取液對(duì)大腸桿菌的最低殺菌濃度是提取液稀釋到1/8,對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低殺菌濃度是提取液稀釋到1/4，說(shuō)明費(fèi)菜提取液對(duì)大腸桿菌的殺菌效果比對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌好。</p><p>　　3.5 費(fèi)菜提取液的還原能力</p&g

64、t;<p>　　Vc和費(fèi)菜提取液經(jīng)還原力測(cè)定結(jié)果曲線</p><p>　　圖7 費(fèi)菜提取液和Vc的還原力吸光度曲線</p><p>　　Fig.7 The absorbance-concentration curve of Aizoon Stonecrop Herb extract and Vc </p><p>　　圖7橫坐標(biāo)是以費(fèi)菜提取液中總黃酮

65、的量來(lái)標(biāo)定的，VC的濃度與費(fèi)菜提取液中總黃酮的濃度一致。費(fèi)菜提取液和VC的吸光度隨著濃度的升高而升高。吸光度越大，樣品還原力越強(qiáng)，從圖7可以得出費(fèi)菜提取液的還原力高，由于提取液中的成份復(fù)雜，一些黃酮類和生物堿類等都具有抗氧化性，和Vc的還原力沒(méi)有相比性，只做參考。此實(shí)驗(yàn)表明費(fèi)菜提取液具有一定的抗氧化能力。</p><p>　　3.6 費(fèi)菜提取液清除羥自由基清的能力</p><p>　　通過(guò)

66、清除率計(jì)算公式得到不同濃度費(fèi)菜提取液和Vc的羥自由基的清除率，繪制曲線，如圖8所示。</p><p>　　圖8 費(fèi)菜提取液和Vc的羥自由基清除能力</p><p>　　Fig.8 Scavenging effect of Aizoon Stonecrop Herb extract and Vc on OH·</p><p>　　圖8橫坐標(biāo)是以費(fèi)菜提取液中總

67、黃酮的量來(lái)標(biāo)定的，Vc的濃度與費(fèi)菜提取液中總黃酮的濃度一致。從圖8中可以看出，隨著費(fèi)菜總提取液的濃度逐漸增加，其清除率也逐步增大，具有良好的量效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中最高濃度的費(fèi)菜總黃酮樣液的最大清除率達(dá)93.79%。由此表明，費(fèi)菜提取液對(duì)羥自由基具有較高的清除能力。Vc只做參考，不做對(duì)照。</p><p>　　3.7 費(fèi)菜提取液清除DPPH﹒的能力</p><p>　　不同濃度費(fèi)菜提取液和Vc對(duì)

68、DPPH﹒的清除率，繪制曲線，如圖9所示。</p><p>　　圖9 費(fèi)菜提取液和Vc的羥自由基清除能力</p><p>　　Fig.9 Scavenging effect of Aizoon Stonecrop Herb extract and Vc on DPPH﹒</p><p>　　圖9橫坐標(biāo)是以費(fèi)菜提取液中總黃酮的量來(lái)標(biāo)定的，Vc的濃度與費(fèi)菜提取液中總黃酮

69、的濃度一致。從圖9中可以看出，隨著費(fèi)菜總提取液和Vc的濃度逐漸增加，其清除率也逐步增大，兩者都具有良好的量效關(guān)系。費(fèi)菜提取液中除了黃酮還有其他抗氧化物質(zhì)存在的條件下，其對(duì)DPPH﹒的清除率不如Vc，所以總的來(lái)說(shuō)，費(fèi)菜提取液提取液清除DPPH自由基能力比Vc弱。</p><p><b>　　4 小結(jié)</b></p><p>　　4.1 費(fèi)菜提取液的抑菌效果</p&

70、gt;<p>　　從表3-5，圖1-4可以得出費(fèi)菜提取液對(duì)三種受試菌有著不同效果的抑制作用。比較費(fèi)菜提取液對(duì)受試菌抑菌圈的直徑大小、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度可知（見(jiàn)表3-5），費(fèi)菜提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用最為強(qiáng)烈，對(duì)金黃色葡萄球菌作用次之，而對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最弱。比較這三種受試菌后發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，大腸桿菌為典型的革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為球菌，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為桿菌，所

71、以從某種程度上來(lái)講費(fèi)菜提取液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌，桿菌和球菌都有一定的抑制作用，可見(jiàn)費(fèi)菜提取液有著廣譜的抑菌效果。而且從MIC和MBC中可以得出，費(fèi)菜提取液對(duì)三種菌完全抑制所需的濃度不大，所以費(fèi)菜提取液如果進(jìn)一步開(kāi)發(fā)可以用在食品、醫(yī)療和農(nóng)業(yè)等方面。費(fèi)菜含有生物堿、谷甾醇、黃酮類、齊敦果酸、景天庚糖，果糖等藥物成分，很多資料表明[23-26]，生物堿和黃酮類化合物具有明顯的抑菌效果，這就是費(fèi)菜抑菌的大致原理，但是由于費(fèi)菜的活性成份很多，具

72、體的原因有待進(jìn)一步研究。</p><p>　　4.2 費(fèi)菜提取液的抗氧化效果</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)以費(fèi)菜提取液為原料，通過(guò)三種方法檢測(cè)其抗氧化活性，結(jié)果表明費(fèi)菜提取液具有一定的抗氧化能力，不同的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，檢測(cè)的是其對(duì)不同能力的抗氧化性，但總的來(lái)說(shuō)費(fèi)菜提取液的抗氧化能力較好。</p><p>　　1）還原力測(cè)定結(jié)果表明費(fèi)菜提取液具有較高還原力，且隨著提取液

73、濃度的升高而增大，從而費(fèi)菜總黃酮具有較好的抗氧化能力。</p><p>　　2）羥自由基清除能力結(jié)果表明費(fèi)菜提取液對(duì)羥自由基具有很強(qiáng)的清除能力，且隨著提取液濃度的升高而增大，在濃度不大的情況下清除率亦可達(dá)到93.79%。</p><p>　　3）DPPH自由基清除能力結(jié)果表明費(fèi)菜提取液對(duì)DPPH自由基有較好的清除能力，且隨著提取液濃度的升高而增大，但相對(duì)于Vc而言，其清除效果不如Vc。&l

74、t;/p><p>　　費(fèi)菜含有生物堿、谷甾醇、黃酮類、齊敦果酸、景天庚糖，果糖等藥物成分，很多資料表明[23-26]，生物堿、黃酮類化合物和一些多糖等具有明顯的抗氧化效果，正是由于費(fèi)菜的這些生理活性物質(zhì)使得它具有抗氧化功能。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 孫執(zhí)中．費(fèi)菜[J]．特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2003，1：

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