土壤多重抗生素抗性放線菌的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)物的初步研究.pdf

1、放線菌的抗生素抗性篩選方法是一種很有效的開(kāi)發(fā)放線菌生物活性物質(zhì)產(chǎn)生潛力的方法，具有效率高、目的性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的研究和應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)三重抗生素抗性法對(duì)土壤中分離得到的放線菌進(jìn)行篩選，旨在為菌種篩選工作提供一條高效、簡(jiǎn)便的新路。
　　 首先對(duì)內(nèi)蒙古呼倫貝爾市、福建省仙游縣、江西省豐城市以及浙江省富陽(yáng)市內(nèi)的4個(gè)樣區(qū)所采集的土壤樣品進(jìn)行自然干燥等預(yù)處理后，采用含有2 μg/mL青霉素及75 μg/mL重鉻酸鉀的高氏一號(hào)培養(yǎng)基

2、進(jìn)行放線菌的初步分離。共分離得到20株放線菌。然后采用鏈霉素(Streptomycin)、慶大霉素(Gentamicin)及利福平(Rifampicin)三重抗性法對(duì)所得到的放線菌進(jìn)行進(jìn)一步篩選。最終得到一株放線菌，它對(duì)鏈霉素抗性為40 μg/mL、慶大霉素抗性為10 μg/mL、利福平抗性為150 μg/mL。并初步命名為1號(hào)放線菌。
　　 將1號(hào)放線菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)其產(chǎn)生物活性物質(zhì)的最佳適發(fā)酵天數(shù)進(jìn)行研究，每隔24 h做

3、鏡檢觀察菌絲體生長(zhǎng)情況，測(cè)定發(fā)酵液pH,測(cè)定生物量，并取不同天數(shù)的發(fā)酵液用于生物活性測(cè)定等試驗(yàn)。最終確定1號(hào)放線菌在該發(fā)酵條件下的最適發(fā)酵時(shí)間為10 d。
　　 以枯草芽孢桿菌ATCC 6633（Bacillus subtilis）以及藤黃微球菌ATCC 9341(Micrococcus
　　 luteus)做為活性檢測(cè)菌，用單層杯碟法測(cè)定1號(hào)放線菌的發(fā)酵液上清及菌體浸提液活性，用游標(biāo)卡尺測(cè)其抑菌圈直徑。結(jié)果得出：1號(hào)放

4、線菌的發(fā)酵液上清及菌體沉淀浸提液對(duì)枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均有抑制活性，對(duì)藤黃微球菌的抑制活性大于枯草芽孢桿菌；發(fā)酵液上清活性大于菌體沉淀浸提液。
　　 分別將發(fā)酵液上清以及菌體浸提液與本實(shí)驗(yàn)室自行表達(dá)純化得到的天冬酰胺合成酶反應(yīng)，測(cè)其對(duì)該酶的抑制活性。結(jié)果顯示，1號(hào)放線菌的發(fā)酵液上清及菌體沉淀浸提液對(duì)天冬酰胺合成酶均顯示了很強(qiáng)的抑制活性，發(fā)酵液上清活性大于菌體沉淀浸提液。
　　 分別對(duì)發(fā)酵液上清以及菌體浸提液用不同溫度

5、處理不同時(shí)間以及調(diào)節(jié)不同pH值處理，測(cè)定處理前后的抑菌活性，以測(cè)定其活性物質(zhì)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：該放線菌的發(fā)酵液上清在50 ℃水浴條件下處理1 h后，其抑菌活性基本喪失，而pH小于4或大于9的酸堿度處理也都會(huì)使其失活；相反，菌體浸提液經(jīng)過(guò)90 ℃水浴1.5 h以及pH達(dá)到2和11的處理后其活性仍然穩(wěn)定。
　　 采用細(xì)菌基因組DNA的小量制備方法提取該放線菌DNA。經(jīng)純化后采用通用引物進(jìn)行16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物測(cè)