海魚異尖線蟲分子檢測和鑒定技術(shù)的研究.pdf

1、異尖線蟲是世界各大海域魚類普遍寄生的寄生蟲。人誤食寄生在海魚體內(nèi)的異尖線蟲科某些種的活的Ⅲ期幼蟲可引起異尖線蟲病(Anisakiasis)。到目前為止已報(bào)道可引起人異尖線蟲病的主要有6種異尖線蟲,即簡單異尖線蟲(Anisakissimplex)、典型異尖線蟲(A.typica)、抹香鯨異尖線蟲(A.physeteris)、擬地新線蟲(Psetwloterranova decipiens)、對盲囊線蟲(Contracaccum spp.)

2、和宮脂線蟲(Hystesterothylacium spp.)。由于異尖線蟲足海洋自然疫源性病原,隨著鮮食魚生的國家和地區(qū)的增多,人類異尖線蟲病在全球已呈擴(kuò)散趨勢。因此,魚類異尖線蟲病病原的人體感染具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。1993年,異尖線蟲病被列入《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》。因異尖線蟲種類繁多,不同種類的異尖線蟲對人類的致病性有所不同。因此,對異尖線蟲種類進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定不僅是從事異尖線蟲研究的基礎(chǔ),也對防

3、治人和動(dòng)物的異尖線蟲病具有重要意義。
　　 本研究以魚類異尖線蟲幼蟲為研究對象,對近年來廈門口岸進(jìn)口的各種海水魚類以及廈門地區(qū)銷售的多種海水魚類的異尖線蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果表明藍(lán)鲹(Decapterus maruadsi)、赤棕魚、竹莢魚(Trachurus japonicus)的異尖線蟲感染率很高,灰海鰻(muraenesox cinereus)、帶魚(Trichiurus haumela)、大眼鯛(Priacanthus

4、macracanthus)也普遍感染異尖線蟲,其中藍(lán)圓鲹、竹莢魚的簡單異尖線蟲的感染率達(dá)到100％。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征對檢獲的異尖線蟲幼蟲進(jìn)行初步分類后,用通用引物擴(kuò)增異尖線蟲幼蟲的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列片段,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并克隆到pGM-T載體中,挑取陽性克隆進(jìn)行測序,根據(jù)基因序列對蟲種進(jìn)行鑒定。結(jié)果共獲得簡單異尖線蟲、典型異尖線蟲、針蛔線蟲(Raphidascaris trichiuri)和對盲囊線蟲等4種異尖線蟲

5、。以這4種異尖線蟲為研究對象,根據(jù)軟件分析,挑選限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、RsaⅠ對其ITS序列進(jìn)行酶切試驗(yàn),建立了能準(zhǔn)確、特異和快速地鑒別簡單異尖線蟲、典型異尖線蟲、針蛔線蟲和對盲囊線蟲4種異尖線蟲的PCR-RFLP方法。
　　 簡單異尖線蟲足我國海魚異尖線蟲寄生的優(yōu)勢種,也是感染人體最常見的異尖線蟲。本研究第二、三兩章豐要以簡單異尖線蟲為研究對象,根據(jù)其ITS保守序列分別設(shè)計(jì)特異性引物,建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和SYBR

6、 GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增檢測方法,對LAMP反應(yīng)體系中dNTPs、Mg2+、Betaine和2對引物的濃度,以及反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化,并進(jìn)行靈敏性和特異性試驗(yàn),同時(shí)用7份樣品進(jìn)行鑒定。經(jīng)優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系為:0.8mmol/L dNTPs、10mmol/L Mg2+、0.8mmol/L Betaine、0.2μmol/L外引物、1.6μmol/L內(nèi)引物、8U Bst DNA聚合酶大片段、1×ThermoPo

7、l bufer以及適量的模板,反應(yīng)程序?yàn)?62℃反應(yīng)60min,80℃滅活5min。本方法檢測簡單異尖線蟲的靈敏度達(dá)到10拷貝/μL,與典型異尖線蟲、對盲囊線蟲、針蛔線蟲無交叉反應(yīng),7份樣品鑒定均為陽性。本研究建立的簡單異尖線蟲熒光定量PCR鑒定方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999:特異性強(qiáng),不能擴(kuò)增典型異尖線蟲、對盲囊線蟲和針蛔線蟲;靈敏性高,可以檢測到10拷貝/μl的ITS重組質(zhì)粒。結(jié)果表明LAMP方法和SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒

8、光定量PCR法靈敏性高、特異性強(qiáng),都是鑒定簡單異尖線蟲的有效手段。其中LAMP法更快速、所需設(shè)備更簡單、操作更簡便、費(fèi)用更低,更適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
　　 典型異尖線蟲也是引起人異尖線蟲病的主要病原之一,國內(nèi)對典型異尖線蟲的報(bào)道很少。本研究建立了鑒定典型異尖線蟲SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法具有快速、特異、敏感、可定量等優(yōu)點(diǎn),是鑒定典型異尖線蟲的有效手段。
　　 本研究在國內(nèi)外首次建立了LAMP技術(shù)