長角血蜱HL-3和HL-4功能基因的克隆及鑒定.pdf

1、長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)作為一種專性吸血外寄生蟲,是許多細菌、病毒、原蟲及立克次氏體等病原體的傳播媒介之一,影響人類和家畜的健康,嚴重制約著我國畜牧業(yè)的發(fā)展,引起重大的經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防控雖然在一定程度上對蜱起到了防控作用,但是蜱耐藥性及環(huán)境污染等問題的出現(xiàn)使得研究新的生物防控途徑成為蜱防控的必然趨勢。近年來以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的疫苗防控為人們研制生物抗蜱疫苗提供了新的思路,而這一途徑的關(guān)鍵在于蜱

2、功能分子的鑒定。本研究采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)對文庫中篩選到的未知基因進行擴增,獲得了目的基因的全長序列,隨后進行克隆和表達,分析其分布及生物學(xué)功能,評估其作為控蜱疫苗候選抗原的可行性,從而為研制抗蜱生物疫苗奠定理論基礎(chǔ)。
　　 采用5'RACE技術(shù)擴增得到了長角血蜱酸性磷酸酶(HL-3)基因的5'端未知序列,通過DNAStar拼接首次獲得了長角血蜱酸性磷酸酶的全長序列。該基因全長1324 bp,含有1137 b

3、p完整的開放式閱讀框(ORF),編碼378個氨基酸,預(yù)測的分子量約42.4 kDa,等電點(pI)為6.35。生物信息學(xué)分析表明,該序列含有3個糖基化位點、一個信號肽和多個磷酸化位點,此外以人的前列腺酸性磷酸酶為模板構(gòu)建了該蛋白的空間三維結(jié)構(gòu)。將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中,獲得了登錄號HM150759。將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1／HL-3置于大腸桿菌中進行大量表達,通過Westernblotting分析該基因顯示出很好的反應(yīng)原

4、性。酶活性分析表明該酶在pH5.0時水解對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)的能力最強。Real-time PCR分析結(jié)果表明:該基因在長角血蜱的不同發(fā)育階段均表達,且在半飽血時期表達量明顯上調(diào)；組織分布表明該基因在部分飽血長角血蜱中腸中的表達豐度明顯高于卵巢和唾液腺；LPS注射和瑟氏泰勒蟲感染能誘導(dǎo)長角血蜱成蜱HL-3基因表達量顯著性上調(diào)。這些結(jié)果表明該基因可能與蜱的發(fā)育、吸血、血液消化和蜱的天然免疫相關(guān)。免疫印記分析表明天然蛋白HL-3在長

5、角血蜱各階段都存在。動物免疫試驗及RNAi實驗證實了該蛋白對蜱的體重及死亡率有一定影響,其他生理指標(biāo)不明顯。
　　 采用5'RACE和3'RACE擴增技術(shù)在已知序列的基礎(chǔ)上設(shè)計特異性的引物進行擴增,測序拼接后得到了1428 bp的長角血蜱的Ras激酶抑制(KSR)錯誤表達抑制基因(HL-4)的全長序列。該基因含有一個1185 bp完整的ORF,編碼395個氨基酸,預(yù)測的分子量為44.57 kDa,等電點(pI)約6.21。生物信

6、息學(xué)分析表明,該序列含有5個糖基化位點,沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,是一種膜外蛋白。將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中,獲得了登錄號HM195183。將目的基因連至表達載體pGEX-4T-1中進行原核克隆表達,Western blotting分析表明該基因具有很好的反應(yīng)原性。Real-time PCR分析表明,該基因在長角血蜱不同發(fā)育階段中均表達,且在半飽血階段表達量升高；在部分飽血蜱中,HL-4基因在卵巢和唾液腺中的表達量明顯高于中腸;