豬PNPLA3、4基因的克隆及功能研究.pdf

1、梅山豬是我國優(yōu)秀地方豬種，是國內(nèi)外豬遺傳育種的重要品種資源，其重要功能基因的克隆、分析鑒定和生物學(xué)特性研究有助于積累和開發(fā)利用我國重要地方豬種的基因資源信息，為優(yōu)良豬種的遺傳改良提供理論依據(jù)。
　　 Patatin作為進(jìn)化中保守的結(jié)構(gòu)域在脂肪代謝中起重要作用。最近發(fā)現(xiàn)的人PNPLAs（patatin-like phospholipases）家族中PNPLA2、3、4在脂肪合成和分解代謝中有重要作用。但是目前未見有關(guān)豬PNPLA3

2、、4基因的研究報(bào)道。為了深入了解豬PNPLA3、4在脂肪代謝中的生物學(xué)功能，本文以梅山豬為研究對象，克隆了PNPLA3、PNPLA4基因及其選擇性剪接體，利用輻射雜種板技術(shù)和電子定位技術(shù)確定了其染色體定位，并采用實(shí)時(shí)定量PCR等方法分析了其組織表達(dá)譜。為了解豬PNPLA3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本文利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄因子KLF15的豬腎細(xì)胞系，通過實(shí)時(shí)定量PCR測定PPARy和PNPLA3 mRNA的表達(dá)差異，并利用油紅O染色法檢測豬腎細(xì)胞積累脂

3、肪含量的變化。本文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1．?dāng)U增得到梅山豬PNPLAs家族．PNPLA3 cDNA序列和PNPLA4含全長編碼區(qū)的cDNA序列，并對其進(jìn)行了DNA和氨基酸序列分析。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增得到的豬PNPLA3 cDNA 2555 bp，編碼區(qū)全長為1326 bp，編碼441個(gè)氨基酸；在蛋白質(zhì)水平上，本實(shí)驗(yàn)獲得的豬PNPLA3氨基酸序列與人（NP 079501）、小鼠（NP 473429）、大鼠（XP 343302）的PN

4、PLA3的同源性依次是61.5％、55.2％、57.2％。擴(kuò)增得到豬PNPLA4 cDNA 819 bp，包括全長編碼區(qū)771 bp，編碼256個(gè)氨基酸；在蛋白水平上，與人的PNPLA4（NP 001135861）有61.5％的同源性。
　　 2．實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在豬中存在PNPLA4的一個(gè)差異剪接體，相對于野生型全長PNPLA4 variant1命名為PNPLA4 variant2，得到包含705bp全長編碼區(qū)的753bp的cDN

5、A序列，編碼234個(gè)氨基酸，它是由野生型．PNPLA4 variant1完全缺失第四個(gè)外顯子66bp所產(chǎn)生。這種剪接方式可能只存在于豬中。通過RT-PCR定性檢測發(fā)現(xiàn)．PNPLA4 variant2除了在肺、脂肪和大腦中沒有檢測到外，在其他組織中都有表達(dá)，但是表達(dá)量低于PNPLA4 variant2。
　　 3．通過輻射雜種板技術(shù)將豬PNPLA3基因定位在5p11－15。通過電子定位技術(shù)將豬PNPLA4定位于Xp24。并且通過比

6、對豬－人比較基因組圖譜證實(shí)這兩個(gè)基因的定位結(jié)果與人相應(yīng)基因在染色體上的位置相對應(yīng)。
　　 4．通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法研究了豬PNPLA3、4基因在mRNA水平上的組織表達(dá)譜。結(jié)果表明豬PNPLA3、4表達(dá)的組織特異性較強(qiáng)，豬PNPLA3在脂肪和肝中高量表達(dá)，在心臟、肺和腎臟中低表達(dá)，在脾、腸、大腦中幾乎檢測不到表達(dá)。豬PNPLA4基因表達(dá)除在肝中表達(dá)量比較高心中有表達(dá)以外，在其他組織中表達(dá)量很低。
　　 5．以遺傳脂肪

7、型豬（通城豬）和遺傳瘦肉型豬（大白豬）的組織樣品為材料，對mRNA水平上PNPLA3在兩種不同類型豬中的組織表達(dá)差異進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示PNPLA3基因在通城豬肝臟中表達(dá)量顯著低于大白豬的相應(yīng)組織，在脂肪組織中差異不顯著。
　　 6．使用已有KLF15的真核表達(dá)載體（PcDNA3.1－KLF15表達(dá)載體）和PcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞24hrs后，油紅O染色法檢測脂肪積累變化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測PPARy，和PNP