miR--275及其靶基因Vg--2對長角血蜱血液消化及卵巢發(fā)育的影響.pdf

1、長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）是一種吸血性外寄生蟲，主要寄生于哺乳動物鳥類體表，廣泛分布于東亞、新西蘭、澳大利亞及我國多個省市，是巴貝斯蟲和泰勒蟲等多種病原的主要傳播媒介，嚴重威脅人類和動物健康。microRNA是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，研究表明，miRNA在吸血性節(jié)肢動物體內發(fā)揮重要作用，尤其是參與吸血和繁殖，因此，深入了解miRNA與長角血蜱發(fā)育繁殖相關的潛在分子機制，為

2、有效免疫防控提供一種新的方法和理論性依據。
　　本實驗通過qPCR的方法分析了miR-275在長角血蜱不同組織及發(fā)育階段的表達水平，結果表明miR-275在長角血蜱各個組織及發(fā)育階段均有表達，且差異性顯著，表明其表達具有組織和階段特異性。在饑餓狀態(tài)下，miR-275在中腸表達量最高，分別是唾液腺和卵巢的1.91倍和1.28倍;與饑餓狀態(tài)相比，飽血狀態(tài)下miR-275在卵巢和中腸的表達量顯著升高，分別升高了2.72倍和1.67倍，而

3、在唾液腺中表達量降低了0.806倍，推測其可能與蜱蟲的卵巢發(fā)育及血液消化有關。分析長角血蜱不同發(fā)育階段miR-275的表達水平，結果表明，飽血雌性成蜱和卵的表達量顯著高于其他階段，推測miR-275在飽血成蜱及卵中發(fā)揮重要功能。
　　利用RNAhybrid軟件對miR-275靶基因進行預測，預測結果發(fā)現miR-275在卵黃原蛋白基因(Vg-2)開放閱讀框中有2個經典的結合位點。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果顯示，實驗組熒光信號活性為66.

4、08％，與對照組相比差異顯著，實驗結果在體外證明miR-275的靶基因為Vg-2。
　　將miR-275抑制劑antagomir(Ant-275)和陰性對照missense(MsAnt)分別注射到饑餓雌性長角血蜱體內，qPCR結果顯示，注射antagomir之后可顯著抑制內源性miR-275(p＜0.05);分析各組蜱蟲的生理指標顯示，與對照組相比，實驗組蜱蟲的卵巢發(fā)育明顯受到抑制，發(fā)育成熟的卵泡量顯著減少;飽血雌蜱產卵量顯著降低

5、、體重下降緩慢、產卵時間延長且完全干癟重量與對照組相比較重（p＜0.01）。在抑制miR-275之后，長角血蜱的卵巢發(fā)育和血液消化均出現異常，表明miR-275在長角血蜱卵巢發(fā)育和血液消化過程中發(fā)揮重要作用。
　　為在體內進一步驗證Vg-2是否為miR-275的靶基因，對長角血蜱進行基因回補實驗。將miR-275抑制劑antagomir和Vg基因抑制劑dsRNA(dsVg)共同注射到饑餓長角血蜱體內，結果顯示，注射Ant-275/