抑制差減雜交分離水稻紋枯病抗性相關基因.pdf

1、水稻紋枯病是世界性的水稻病害，對水稻生產威脅巨大。在各洲水稻種植國家普遍發(fā)生，一般減產10％～30％，嚴重時可達50％。該病在我國已經成為最嚴重的水稻病害，目前還未見有關發(fā)現對該病高抗的水稻品種。該病的致病菌，立枯絲核菌寄主范圍大，分布廣泛，自然狀態(tài)下不產生無性孢子，常以菌核形態(tài)習居于土壤。根據菌絲融合與否，立枯絲核菌可以劃分為14個融合群，其中引起水稻紋桔病的是AG-1-IA融合群。隨著農桿菌介導的水稻轉基因技術的不斷發(fā)展，構建T-D

2、NA插入突變體庫已成為分析和鑒定基因功能的重要途徑。水稻T-DNA插入突變體可以方便地進行正向和反向遺傳學的研究，因而將成為進一步克隆抗性相關基因的重要研究材料，以及作為水稻育種新抗源加以利用。抑制差減雜交技術通過有選擇地擴增差異表達基因并抑制非目的基因的擴增，來比較同一類細胞在不同生理狀態(tài)下的基因表達差異，為分析生命活動提供重要信息，作為克隆新基因、研究基因表達的有效工具被廣泛應用于從各類生物中篩選差異表達基因，特別是與致病相關的基因

3、。 本研究試圖從水稻的T-DNA突變體中找到水稻紋枯病的抗性相關基因，主要研究結果如下： 1.鑒定了于浙江省各地采集的60株水稻紋枯病菌株的菌絲融合群歸屬情況。該60個菌株均與AG-1融合群的3個亞群AG-1-IA、AG-1-IB、AG-1-IC的標準菌株融合，當屬AG-1融合群。通過離體接種對菌株致病力進行鑒定發(fā)現，各菌株間致病力差異顯著。進一步的ITS序列分析顯示，系統發(fā)育樹的結果與融合群鑒定的結果一致，與菌株間致病

4、力差異無相關性。 2.對日本晴水稻T-DNA突變體庫中隨機挑選出的2576個材料，首先利用撒施法接種進行了水稻紋枯病抗性鑒定，發(fā)現多數為高感材料，抗病及中抗株系共有36個，僅占1.4％，中感株系有180個，占7.0％。再利用嵌入法接種對初篩選出的上述216個株系進行進一步抗性鑒定，篩選出18個抗性表現較好的株系。在溫室利用微室法對這18個株系進行進一步抗性鑒定，發(fā)現15個突變體株系問抗性差異不顯著，然而有17個突變體株系都與野生

5、型有顯著差異。 3.利用Tail PCR鑒定了1株對水稻紋枯病有特異抗性的日本晴T-DNA突變體的T-DNA插入位點。應用抑制差減雜交(Suppression subtractive hybidi-zation，SSH)技術，構建了該突變體經紋枯病菌誘導表達的正向和反向抑制差減cDNA文庫。陽性克隆測序后進行Contig重組，得到了309個cDNA序列。序列經過Blast同源序列比對，219個序列得到了匹配的同源基因，并對同源基