抑制差減雜交分離水稻紋枯病抗性相關(guān)基因.pdf

1、水稻紋枯病是世界性的水稻病害，對水稻生產(chǎn)威脅巨大。在各洲水稻種植國家普遍發(fā)生，一般減產(chǎn)10％～30％，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50％。該病在我國已經(jīng)成為最嚴(yán)重的水稻病害，目前還未見有關(guān)發(fā)現(xiàn)對該病高抗的水稻品種。該病的致病菌，立枯絲核菌寄主范圍大，分布廣泛，自然狀態(tài)下不產(chǎn)生無性孢子，常以菌核形態(tài)習(xí)居于土壤。根據(jù)菌絲融合與否，立枯絲核菌可以劃分為14個(gè)融合群，其中引起水稻紋桔病的是AG-1-IA融合群。隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，構(gòu)建T-D

2、NA插入突變體庫已成為分析和鑒定基因功能的重要途徑。水稻T-DNA插入突變體可以方便地進(jìn)行正向和反向遺傳學(xué)的研究，因而將成為進(jìn)一步克隆抗性相關(guān)基因的重要研究材料，以及作為水稻育種新抗源加以利用。抑制差減雜交技術(shù)通過有選擇地?cái)U(kuò)增差異表達(dá)基因并抑制非目的基因的擴(kuò)增，來比較同一類細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下的基因表達(dá)差異，為分析生命活動(dòng)提供重要信息，作為克隆新基因、研究基因表達(dá)的有效工具被廣泛應(yīng)用于從各類生物中篩選差異表達(dá)基因，特別是與致病相關(guān)的基因

3、。 本研究試圖從水稻的T-DNA突變體中找到水稻紋枯病的抗性相關(guān)基因，主要研究結(jié)果如下： 1.鑒定了于浙江省各地采集的60株水稻紋枯病菌株的菌絲融合群歸屬情況。該60個(gè)菌株均與AG-1融合群的3個(gè)亞群AG-1-IA、AG-1-IB、AG-1-IC的標(biāo)準(zhǔn)菌株融合，當(dāng)屬AG-1融合群。通過離體接種對菌株致病力進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，各菌株間致病力差異顯著。進(jìn)一步的ITS序列分析顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果與融合群鑒定的結(jié)果一致，與菌株間致病

4、力差異無相關(guān)性。 2.對日本晴水稻T-DNA突變體庫中隨機(jī)挑選出的2576個(gè)材料，首先利用撒施法接種進(jìn)行了水稻紋枯病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)多數(shù)為高感材料，抗病及中抗株系共有36個(gè)，僅占1.4％，中感株系有180個(gè)，占7.0％。再利用嵌入法接種對初篩選出的上述216個(gè)株系進(jìn)行進(jìn)一步抗性鑒定，篩選出18個(gè)抗性表現(xiàn)較好的株系。在溫室利用微室法對這18個(gè)株系進(jìn)行進(jìn)一步抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)15個(gè)突變體株系問抗性差異不顯著，然而有17個(gè)突變體株系都與野生

5、型有顯著差異。 3.利用Tail PCR鑒定了1株對水稻紋枯病有特異抗性的日本晴T-DNA突變體的T-DNA插入位點(diǎn)。應(yīng)用抑制差減雜交(Suppression subtractive hybidi-zation，SSH)技術(shù)，構(gòu)建了該突變體經(jīng)紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的正向和反向抑制差減cDNA文庫。陽性克隆測序后進(jìn)行Contig重組，得到了309個(gè)cDNA序列。序列經(jīng)過Blast同源序列比對，219個(gè)序列得到了匹配的同源基因，并對同源基