外源基因GAFP提高水稻紋枯病抗性的效應(yīng)研究.pdf

1、水稻原產(chǎn)亞熱帶，是中國(guó)乃至世界的重要糧食作物之一，也是我國(guó)一半以上人口的主糧。而紋枯病是水稻的三大病害之一，俗稱(chēng)爛腳病，花腳桿。隨著植株矮化，栽培密度和施肥水平的提高，紋枯病的危害日益加重。根據(jù)調(diào)查顯示，紋枯病已經(jīng)成為了中國(guó)南方部分水稻種植區(qū)的第一大病害，嚴(yán)重威脅著水稻的產(chǎn)量。本研究從天麻中分離得到天麻抗真菌蛋白（簡(jiǎn)稱(chēng)GAFP）及其3個(gè)同源序列，并通過(guò)添加信號(hào)肽進(jìn)行載體優(yōu)化，共構(gòu)建了8個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到徐稻3號(hào)和R6

2、547中，并通過(guò)組培手段得到轉(zhuǎn)化苗，然后進(jìn)行分子檢測(cè)和田間鑒定，確定其是否能提高水稻對(duì)紋枯病的抗性。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴徐稻3號(hào)的培養(yǎng)基的選擇:徐稻3號(hào)在N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密、顏色為嫩黃色、呈顆粒狀、表面光滑、生長(zhǎng)旺盛。而在MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色為暗黃色、呈不分散的表面水漬狀，不利于繼代培養(yǎng)。所以選擇N6培養(yǎng)基。⑵添加ABA對(duì)水稻成熟胚愈傷組織的影響:與不添加ABA相比，添加ABA可有效的抑制胚芽生長(zhǎng)

3、，并有利于胚性愈傷的形成，獲得的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)地堅(jiān)硬，表面有突起，呈乳白色，并稍提高其成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率。⑶水稻愈傷組織對(duì)篩選劑G418的敏感測(cè)驗(yàn):，R6547的愈傷組織比徐稻3號(hào)的愈傷組織對(duì)G418更敏感。徐稻3號(hào)的愈傷組織在添加350mg/L的G418時(shí)對(duì)本身產(chǎn)生傷害，但是添加50-150mg/L時(shí)，對(duì)愈傷組織沒(méi)有選擇的作用，所以在250mg/L的G418時(shí)，是選擇抗性愈傷組織的最適濃度，所以本試驗(yàn)徐稻3號(hào)的G418一篩濃

4、度為150mg/L，二篩濃度為250mg/L;同理R6547的G418一篩濃度為100mg/L，二篩濃度為150mg/L。⑷通過(guò)PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子和陽(yáng)性純系;然后進(jìn)行Southern雜交證實(shí)基因已經(jīng)整合到受體基因組中及其拷貝數(shù);實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。⑸徐稻3號(hào)和R6547有7個(gè)載體的轉(zhuǎn)化后代進(jìn)入T2代抗性鑒定試驗(yàn)，這7個(gè)載體分別為G1、G2、SG2、G3、SG3、G4、SG4，共計(jì)116個(gè)純合轉(zhuǎn)化株系參試。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相