榨菜低鹽腌制體系中優(yōu)勢種群的分子鑒定及分析【文獻綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　榨菜低鹽腌制體系中優(yōu)勢種群的分子鑒定及分析</p><p>　　摘要：本文對我國蔬菜傳統腌制工藝過程中的最佳鹽度、主要微生物類群進行了較為全面的論述,對提高蔬菜傳統腌制品的質量有一定的指導意義。同時概述

2、了16S rDNA技術的原理及其在食品微生物檢測中的應用與研究進展，并探討了這些技術的發(fā)展和應用前景。</p><p>　　關鍵字：低鹽腌制；乳酸菌；16S rDNA</p><p>　　蔬菜的腌制加工，在我國已有悠久的歷史。勞動人民在長期生產實踐中積累了豐富的經驗。但是傳統的蔬菜腌制工藝均采用高鹽進行腌制。這樣，成品鹽度太高，而食用過多的食鹽對人體某些器官會造成永久性損壞[1]。所以，我

3、國人民對高鹽腌制食品也越來越不歡迎，取而代之的低鹽方便的軟包裝腌制蔬菜產品正在占領市場[2]。</p><p>　　隨著分子生物學技術的發(fā)展，食品微生物的分子生物學研究進入了一個新階段，人們對于微生物在分子和基因水平的認識不斷深入。近年來，SSCP技術為已經廣泛地應用于到環(huán)境和食品(包括腌制蔬菜)微生物的研究中[3,4]。采用的SSCP方法體現了一種快速、簡易的研究微生物群落結構的方法[5]，但是測序列較短，個別

4、可能只確定屬、科分類地位，無法精確地鑒定到種，所以結合16S rDNA/rRNA的序列分析來進一步來進行研究。16S rDNA或16S rRNA 序列既具有保守性, 又具有高變性, 是目前細菌分類和鑒定經常使用的一種檢測方法[6,7]。</p><p>　　蔬菜低鹽腌制的最佳鹽度</p><p>　　一般來講，榨菜含鹽量愈高，愈有利于榨菜的保存，也有利于保持榨菜的香味和滋味。但由于高鹽度條

5、件下腌制的蔬菜含鹽量太高，食用過多的食鹽對人體的某些器官如腎脈和心血管系統等會造成永久性損壞。然而，榨菜含鹽越低，雖然可以保持蔬菜原有的營養(yǎng)成分，卻不利于榨菜的保質貯存。并且在低鹽條件下勢必引起各種微生物的生長，因此，在此條件下使腌制保藏過程正?；倪^程是一個十分復雜的微生物學發(fā)酵過程，同時伴隨著復雜的生物化學變化和物理變化，搞清正常腌制過程的微生物的作用以及相應的物質變化關系[8,9]，對制訂合理的生產工藝實現蔬菜腌制的清潔生產提供技

6、術保證。李學貴[1]等通過研究總結出當含鹽量為5%時為榨菜腌制的最佳鹽度。</p><p>　　2 蔬菜的低鹽腌制中的主要微生物</p><p>　　目前,我國各種蔬菜腌制品的發(fā)酵,都是借助于天然附著在蔬菜表面上的微生物的作用來進行的。據測定,蔬菜收獲后表面所含的微生物不僅種類多,而且數量大,大白菜外葉含微生物約13×108/g ,根菜類表面所含的數量更大,但有益菌一般數量都較低

7、【10】。</p><p><b>　　2.1 乳酸菌</b></p><p>　　乳酸菌是一類革蘭氏陽性菌,以產生乳酸作為發(fā)酵代謝中主要或唯一代謝產物特征的細菌。它屬于兼性厭氧菌。在自然界分布廣,種類多[11]。在蔬菜腌制發(fā)酵中的乳酸菌分別屬于糞鏈菌屬、明串球菌屬、片球菌屬和乳桿菌屬。其中，在蔬菜初始發(fā)酵階段和主發(fā)酵階段起主要作用的乳酸菌主要為糞鏈球菌、腸膜明串珠菌

8、和短乳桿菌。</p><p>　　腸膜明串珠菌的快速生長降低了pH值,從而抑制了有害微生物的生長和軟化蔬菜酶的活性；產生的CO2替代了空氣,造成厭氧環(huán)境,不僅有利于穩(wěn)定蔬菜中的色澤,而且也有利于其它乳酸菌按一定的順序生長；產生的酸、醇等與其它產物結合起來,使產品具有特有的風味；腸膜明串珠菌能把多余的糖轉化成甘露醇和葡聚糖,甘露醇和葡聚糖一般只能被乳酸菌利用,而不能被其它微生物利用,也不能與氨基酸結合成醛基或酮基,

9、因此不會引起食品的褐變。短乳酸菌能夠發(fā)酵戊糖,使產品具有獨特的風味。</p><p><b>　　2.2 酵母菌</b></p><p>　　蔬菜腌制中酵母菌可以從蔬菜采摘后本身表面帶來,也有從腌制工具和空氣中自然落入而來。蔬菜腌制中常見的酵母主要是啤酒酵母、產醭酵母和魯氏酵母等。</p><p>　　酵母發(fā)酵所生成的乙醇對腌制品在后熟階段發(fā)生

10、酯化反應和生成芳香物質是很重要的。其它醇類的產生對風味也有一定的影響。酵母菌產生的乙醇也作為醋酸菌進行醋酸發(fā)酵的基質。</p><p><b>　　3 分子檢測技術</b></p><p>　　對環(huán)境中微生物種群的類型和數量進行及時和準確的分析測定在微生物生態(tài)研究中十分重要, 傳統的微生物分析測定方法, 在環(huán)境樣品研究中都存在一定的缺陷。近年來, 一些分子生物學技術的

11、聯合應用[12]，使我們不僅可以定性，還可定量研究微生物菌落結構組成及數量變化，深入探索微生物菌落與環(huán)境因子之間的相互作用及其動態(tài)變化過程。</p><p>　　3.1 16S rDNA技術原理</p><p>　　細菌含有3種不同的RNA，即mRNA、tRNA和rRNA。其中rRNA是蛋白質合成必需的，所以它們廣泛存在于所有的原核生物中，并且結構和功能都是保守的；16S rDNA的序列中

12、包括可變區(qū)和高變區(qū)，因此既可以利用保守區(qū)域來設計引物，又可以利用高變區(qū)來進行序列間的比對它們的序列變化比較緩慢而且在原核生物中不發(fā)生水平轉移，因此16S rDNA 之間序列的差異可以反映不同生物之間的進化關系。</p><p>　　從上世紀70年代以來,科學家們因16S rRNA的保守性, 對其進行了大量研究工作,現在已對16S rDNA序列有了清晰的認識。在細菌的16S rDNA中有多個區(qū)段高度保守[13],

13、根據這些保守區(qū)人們可以設計出細菌的通用引物, 可以用來擴增出所有細菌的16S rDNA片段, 并且這些引物僅對細菌是特異的, 也就是說這些引物不會與非細菌的DNA互補, 而細菌的16S rDNA可變區(qū)的差異則可以用來區(qū)分不同的菌。因此, 16S rDNA可以作為細菌群落結構分析最常用的系統進化標記分子[14]。</p><p>　　3.2 16S rDNA技術基本研究方法</p><p>

14、　　根據以上原理，我們從環(huán)境微生物樣品中提取出rRNA或總DNA后，就可以利用PCR擴增、核酸雜交、梯度電泳和DNA測序等技術分析微生物樣品的16S rDNA，從而對環(huán)境微生物進行檢測，或對其進行分類、定位[15]。</p><p>　　無論是全長還是部分16S rDNA/rRNA 序列, 都可以提交到國際互聯網GeneBank, 采用BLAST和RDP(Ribosomal Database Project Pr

15、ograms)與已知序列進行相似性分析, 然后進行系統發(fā)育分析。</p><p>　　3.3 16S rDNA在微生物學研究中的應用</p><p>　　白潔[16]等人采集黃海西北部海域春秋2個季節(jié)的沉積物樣本,采用微生物分子生物學技術,構建細菌16S rDNA文庫,并進行序列測定和多樣性指數分析,探討細菌群落結構和分布特征,研究鄰界水域、人類活動以及黃海冷水團等自然和人為因素對黃海西北

16、部微生物種類組成、數量、優(yōu)勢菌群等的影響,以及功能微生物對環(huán)境因子的響應,有助于深層次理解該海域沉積物的生態(tài)系統結構和功能,為我國近海微生物資源及生態(tài)環(huán)境的研究提供理論依據。</p><p>　　在水產養(yǎng)殖中應用l6S rDNA分析方法能使研究者更深入地洞察養(yǎng)殖水生環(huán)境的細菌多樣性[17]，為水產養(yǎng)殖生態(tài)系統群落結構調查奠定基礎。16S rDNA技術也開始應用于水環(huán)境細菌群落和魚類消化道細菌群落的調查，如李志崗[

17、18]等利用l6S rDNA限制性片斷長度多態(tài)性分析了水環(huán)境細菌群落結構。</p><p>　　目前, 16S rDNA序列分析方法在乳酸菌分類鑒定運用比較多, 用PCR產物建立16S rRNA基因克隆庫通過16S rDNA序列分析確定身份。并與有關的16S rRNA數據庫比較建立分類學上的關系[19]。Choi[20]利用16S rDNA序列分析和DNA雜交技術研究了泡菜中乳酸菌的菌群變化, 在泡菜5d的發(fā)酵過

18、程中隨機分離出120株乳酸菌, 結果發(fā)現在發(fā)酵的前中期, 檸檬明串珠菌(L.citreum)是優(yōu)勢種, 然而在發(fā)酵后期主要為清酒乳桿菌(L.sake)或彎曲乳桿菌(L.curvatus)以及短乳桿菌。烏日娜[7]等采用16S rDNA測序和同源性分析的方法, 以大于98%的同源性將L.casei.zhang和ZL12-1分別鑒定為 L.casei subsp.casei和L. gallinarum。燕平梅[21]等利用16S rDNA基

19、因序列方法分析傳統發(fā)酵菜中乳酸菌的多樣性，得出4種獨特的菌落，并且利用這種分子方法發(fā)現了常規(guī)分離培養(yǎng)技術未鑒定的乳酸菌。</p><p>　　構建克隆文庫是微生物分子生態(tài)學中用來研究微生物組成的常用方法之一,目前細菌菌群分析中應用最多的是16S rDNA克隆文庫方法[22]。它是通過對16S rDNA全長序列進行擴增和分析,達到研究和監(jiān)測樣品與環(huán)境中細菌多樣性、種群結構和區(qū)系變化的目的,并應用于水體、土壤、海洋沉

20、積物、生物水處理系統中的微生物分析[23]。通過建立16S rDNA克隆文庫的方法,通過測序并與已知序列比較確定細菌種類,以揭示有機物料腐熟菌劑樣品中的細菌組成,同時也可以根據克隆文庫中克隆子出現的頻率了解樣品的細菌組成比例[24]。</p><p>　　近年來T Yamamoto等設計和合成出人腸道區(qū)系中常見的雙歧桿菌屬5個種(兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌和長雙歧桿菌)的特異性的寡核苷酸

21、探針, 它們具有16-19個堿基長度, 并與這5個種的16S rRNA序列互補[25]。用天然高分子量的RNA制備物作為靶子,這些寡核苷酸探針對于人腸道中這些種的菌株具有高度的種特異性, 結果表明用此法檢測這5個種的16S rRNA序列能取得所期望的結果, 并且整個試驗過程從獲得純細胞物后只需6h可完成。</p><p>　　4 存在的問題和展望</p><p>　　傳統的表型、生物化學方

22、法鑒定微生物耗時耗力,而且培養(yǎng)條件的改變可能會導致結果發(fā)生變化,鑒定結果很不穩(wěn)定,其結果也仍是表觀的, 很難反映生物的遺傳本質。隨著分子生物學和相關技術的發(fā)展, 分子標記技術以其快速、準確、靈敏的優(yōu)點逐漸成為微生物分類鑒定的主要手段。盡管如此,目前還沒有一種分子標記技術能單獨勝任對微生物的鑒定, 只有同其他方法結合起來進行比較研究,尤其是傳統方法和分子生物學方法結合起來對微生物的分類鑒定才會得到比較滿意的結果。由于16SrRNA 序列的

23、保守性和存在的普遍性, 以及核酸序列本身的穩(wěn)定性、序列分析的重現性極高, 基于當今分析技術的改進, 應用16SrRNA作為分子指標, 可以實現快速、微量、準確簡便的對微生物進行分類鑒定。分子分類正是在從研究的目的過渡到研究的手段。隨著分子分類的理論和方法的日趨成熟, 其已逐步成為微生物資源調查和整理的一種強有力工具。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><

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