東方山羊豆抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆和相關(guān)研究.pdf

1、東方山羊豆（Galega． orientalis L．）為豆科山羊豆屬植物，是一種優(yōu)質(zhì)的飼用牧草。東方山羊豆產(chǎn)草量高，利用年限長(zhǎng)，抗逆、抗病性強(qiáng)，適口性好，具有促進(jìn)奶牛產(chǎn)奶量和乳脂率的提高等功能，適宜建植人工草地與改良天然草地，在我國“退耕還草、退牧還草、草田輪作”中應(yīng)用前景將十分廣闊，對(duì)東方山羊豆這些特性的深入研究和開發(fā)利用具有非常重要的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)意義。為了探討東方山羊豆應(yīng)答環(huán)境脅迫的分子機(jī)制，本論文開展了抗逆轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的分離、

2、克隆以及表達(dá)特性分析，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株，為探討和改良牧草對(duì)非生物脅迫的耐性提供了理論依據(jù)和技術(shù)保障。目前，取得如下的研究進(jìn)展： 一、分離了1個(gè)冷誘導(dǎo)的東方山羊豆ERF轉(zhuǎn)錄因子基因GoDREB全長(zhǎng)序列，初步明確了其特性及功能。 1．采用RACE的克隆方法，從東方山羊豆中克隆到一個(gè)ERF類轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為GoDREB?；蛐蛄蠴RF區(qū)為1095bp，編碼一個(gè)由364個(gè)氨基酸組成的蛋白。序列分析表明：GoDR

3、EB基因中具有一個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為1332 bp，在ORF的第255個(gè)核苷酸（T）與第256個(gè)核苷酸（A）之間； GoDREB基因具有ERF轉(zhuǎn)錄因子所特有的核定位信號(hào)、DNA結(jié)合域以及轉(zhuǎn)錄激活域；它與其他已知的ERF基因除了在保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域處具有很高的同源性外，在其它的區(qū)域同源性也較高。GoDREB具有植物ERF轉(zhuǎn)錄因子典型的結(jié)構(gòu)特征，是植物ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)新成員，屬于該轉(zhuǎn)錄因子家族的classⅣ亞族。 2

4、．采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，對(duì)東方山羊豆逆境脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GoDREB在東方山羊豆中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)不僅受低溫、PEG和鹽誘導(dǎo)，而且也受外源激素MeJA和SA的誘導(dǎo)；其中，受低溫誘導(dǎo)的變化明顯早于PEG和鹽誘導(dǎo)，而對(duì)ABA的誘導(dǎo)幾乎沒有響應(yīng)，由此推測(cè)GoDREB可能主要通過SA/JA途徑參與對(duì)逆境的早期防衛(wèi)反應(yīng)，而不依賴于ABA途徑。運(yùn)用半定量RT-PCR方法，分析了GoDREB基因在東方山羊豆不同組織中的表達(dá)特異

5、性，結(jié)果表明：東方山羊豆GoDREB基因在三種組織中的表達(dá)存在差異，相比而言在葉中的表達(dá)最強(qiáng)，在莖中的表達(dá)較弱，而在根中的表達(dá)量為最弱。GoDREB基因在各個(gè)器官都具有一定的表達(dá)量說明它本身是一個(gè)組成型表達(dá)的基因。 3．通過分子分析證明GoDREB是定位在細(xì)胞核。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，pCAMBIA1302-GoDREB-GFP融合蛋白集中分布在細(xì)胞核中，而對(duì)照pCAMBIA1302在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，證明了GoDREB具

6、有核定位的特性。 4．獲得了轉(zhuǎn)GoDREB基因煙草植株。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GoDREB轉(zhuǎn)入煙草中，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和RT-PCR鑒定。結(jié)果表明，GoDREB基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，并可在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。 二、分離到1個(gè)冷誘導(dǎo)的東方山羊豆RAV轉(zhuǎn)錄因子基因GoRAV全長(zhǎng)序列，初步明確了其特性及功能。 1．通過RT-PCR和RACE方法，分離到1個(gè)冷誘導(dǎo)的東方山羊豆RAV轉(zhuǎn)錄因子編碼基因Go

7、RAV，ORF區(qū)為1164bp，編碼由387個(gè)氨基酸殘基組成的RAV轉(zhuǎn)錄因子GoRAV。通過分析GoRAV基因的結(jié)構(gòu)，證明在該基因內(nèi)部沒有內(nèi)含子。序列比對(duì)分析表明，GoRAV是RAV轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)新成員。GoRAV與豆科植物大豆GmRAV的一致性最高，與雙子葉植物的RAV具有相對(duì)較高的同源性，而與單子葉植物的序列一致性略低。 2．通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了GoRAV在逆境脅迫下的表達(dá)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GoRAV基因在東方山

8、羊豆中能夠被PEG和低溫、以及外源植物激素ABA、SA和MeJA誘導(dǎo)，初步推測(cè)GoRAV可能通過ABA/MeJA信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與東方山羊豆對(duì)逆境的防御反應(yīng)。半定量RT-PCR方法分析GoRAV基因在東方山羊豆不同組織中的表達(dá)特異性，結(jié)果表明：GoRAV基因在三種組織中的表達(dá)存在差異，在根中不表達(dá)，在莖和葉中均有較強(qiáng)的表達(dá)。 3．通過分子分析證明GoRAV是定位在細(xì)胞核。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，pCAMBIA1302-GoRAV-GF