蠟梅ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CpABC的克隆與功能的初步分析.pdf

1、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-Binding Cassette transporter，ABC transporter)是一種廣泛存在于原核生物以及真核生物中的一類超級(jí)大家族蛋白，是目前已經(jīng)研究的功能最廣泛、蛋白數(shù)量最多的一種。它主要作為一種跨膜蛋白存在于生物膜上。近幾十年來，人們發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在很多生物中(包括原核和真核生物)會(huì)參與一些重要的生理過程，例如植物體內(nèi)次生產(chǎn)物的代謝過程、細(xì)菌的耐藥性過程，甚至人體內(nèi)一些腫瘤細(xì)胞的抗藥性過程都

2、有非常密切的聯(lián)系，因而具有重要的研究價(jià)值，于是，人們開始廣泛關(guān)注和研究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。蠟梅(Chimonanthus praecox(L.)Link)原產(chǎn)中國，是第三紀(jì)孑遺植物和中國國家二級(jí)珍稀瀕危植物。12月至翌年早春2月孕蕾開花，于數(shù)九寒天，傲然開放于凜冽霜風(fēng)中，為典型的“冬花”植物，素有“三耐”(耐寒、耐旱、耐剪)與“三不”(凍不壞、旱不死、不缺枝)的稱譽(yù)，耐寒力極強(qiáng)是蠟梅的最大特點(diǎn)，只要不低于-15℃均能露地安全越冬。
　

3、　 本文從蠟梅花器官中克隆到一個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CpABC并在大腸桿菌中表達(dá)，然后對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，取得主要結(jié)果包括：⑴蠟梅ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆。通過隨機(jī)挑選蠟梅cDNA文庫測(cè)序，獲得了大小為707bp的EST序列，然后通過hiTAIL-PCR、RACE等技術(shù)克隆出cDNA全長。BLASTX比對(duì)結(jié)果顯示，其與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有很高的同源性，初步推定所獲得的cDNA編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名為CpABC。CpABCcDNA全長28

4、18bp，其中含有2145bp的開放閱讀框，編碼蛋白長714個(gè)氨基酸。⑵植物表達(dá)載體的構(gòu)建。將CpABC ORF框片段連接到pMD-19T載體上，然后用BamHI和SacI分別雙酶切克隆載體和表達(dá)載體pCAMBIA2301g，回收目的片段和表達(dá)載體并連接，經(jīng)酶切和PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建了含有目的基因的表達(dá)載體。⑶原核表達(dá)載體構(gòu)建。設(shè)計(jì)帶BamH I和SacI酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增蠟梅CpABC基因，用BamH I和SacI分別雙酶切蠟

5、梅CpABC基因和原核表達(dá)載體PET-28a，然后將蠟梅CpABC基因連接到原核表達(dá)載體PET-28a上，經(jīng)過酶切、PCR驗(yàn)證和測(cè)序，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了含有目的基因的原核表達(dá)載體。⑷CpABC基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過合適的誘導(dǎo)條件，誘導(dǎo)CpABC基因在Transetta(DE3)菌株中表達(dá)，并通過SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白證明了CpABC基因的表達(dá)。⑸CpABC基因的表達(dá)分析。CpABC在