無(wú)載體無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因耐貯藏甜瓜的培育.pdf

1、甜瓜是世界上十大水果之一,河套蜜瓜是內(nèi)蒙古西部河套地區(qū)特產(chǎn)的地方優(yōu)良甜瓜品種,是本地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一。其果實(shí)是典型的呼吸躍變型果實(shí),成熟后迅速軟化腐爛,嚴(yán)重制約河套蜜瓜生產(chǎn)的發(fā)展。
　　 本論文以河套蜜瓜成熟果實(shí)的RNA為模板,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分別克隆得到ACC合成酶1(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS1)、ACC氧化酶1(1-aminocyclopro

2、pane-1-carboxylic acid oxidase,ACO1)、乙烯受體ETR2和3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme Areductase,HMGR)基因的全長(zhǎng)cDNA序列,序列分析表明,各基因cDNA長(zhǎng)分別為:ACS11531bp,編碼493個(gè)氨基酸；ACO11035bp,編碼318個(gè)氨基酸；ETR22304bp,編碼767個(gè)氨基酸；HMGR1939b

3、p,編碼588個(gè)氨基酸。與已報(bào)道的甜瓜各基因cDNA的序列同源性很高,所編碼的蛋白質(zhì)序列完全一致。
　　 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段的甜瓜果實(shí)中各基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,ACS1和ACO1基因的表達(dá)從授粉后第30天(dayafter pollination,DAP)起表達(dá)量開(kāi)始增加,40DAP表達(dá)量迅速躍變達(dá)到最大,之后下降,與15DAP相比,兩者分別增加了60倍和30萬(wàn)倍的表達(dá)量。ETR2基因在

4、15DAP至30DAP表達(dá)沒(méi)有變化,35DAP表達(dá)量開(kāi)始上升,上升趨勢(shì)一直持續(xù)至45DAP,最高表達(dá)量為15DAP的9倍。HMGR基因的表達(dá)在25DAP有一個(gè)峰值,表達(dá)量為15DAP的3倍,之后下降,在35DAP表達(dá)量又開(kāi)始回升,到40DAP達(dá)到最大值后開(kāi)始下降,最高表達(dá)量為15DAP的16倍。
　　 以植物雙元表達(dá)載體pPZP221(GenBank中登錄號(hào):U10491)為構(gòu)建的初始載體,用限制性內(nèi)切酶PmeI和AseI雙酶切

5、去除植物抗性選擇標(biāo)記慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aacC1(Gentamycin acetyltransferase gene),并在該位點(diǎn)重新插入CaMV35S啟動(dòng)子和nos終止子序列,獲得載體pPZP201(35S-nos)。分別將ACS1基因cDNA編碼區(qū)的588bp和ACO1基因cDNA編碼區(qū)的710bp片段反向構(gòu)建到pPZP201(35S-nos)載體,命名為pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1。用限制性內(nèi)切酶PsyⅠ

6、和PaeⅠ雙酶切載體pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1,獲得無(wú)載體骨架序列無(wú)選擇標(biāo)記基因的長(zhǎng)約2.3kb的RB-35S-反向目的片段-nos-LB線性表達(dá)盒。
　　 采用花粉管通道法將構(gòu)建好的各基因的線性表達(dá)盒導(dǎo)入河套蜜瓜,獲得大量轉(zhuǎn)化種子。PCR檢測(cè)證明外源基因已經(jīng)整合到受體植物的基因組中,經(jīng)表型篩選證實(shí),已經(jīng)獲得了耐貯性強(qiáng)的T2代轉(zhuǎn)反義ACS1和反義ACO1基因株系。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)證明反義ACO1基因已經(jīng)

7、在轉(zhuǎn)基因果實(shí)中表達(dá)。T2代轉(zhuǎn)反義ACS1和反義ACO1基因果實(shí)的乙烯含量分別為對(duì)照果實(shí)乙烯合成量的7％和5％左右,轉(zhuǎn)基因果實(shí)在常溫下貯藏30天時(shí),果實(shí)硬度基本保持不變,果實(shí)不過(guò)熟、不霉變。而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ展麑?shí)在12天內(nèi)已經(jīng)軟化腐爛。對(duì)T2代轉(zhuǎn)反義ACO1基因甜瓜花特性的研究表明,轉(zhuǎn)基因甜瓜與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗鸸显诨ǚ坌螒B(tài)、花粉萌發(fā)特性上無(wú)明顯差異。轉(zhuǎn)基因甜瓜兩性花著生節(jié)位(第11節(jié))高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗鸸蟽尚曰ㄖ?jié)位(第8節(jié))。轉(zhuǎn)基因甜瓜花梗