無載體骨架無選擇標記玉米轉化體系的優(yōu)化.pdf

1、植物轉基因技術的研究和新產品的開發(fā)已取得了突破性進展，在解決人類面臨的環(huán)境污染、資源短缺等問題顯示出巨大的作用。但是，近年來隨著人們對生物安全性的關注，載體骨架序列和選擇標記基因作為“垃圾DNA”影響著轉基因植物的安全性評價。因此，建立無載體骨架無選擇標記的轉基因技術已成為植物基因工程領域的研究熱點。雖然花粉管通道法可以將線性DNA片段導入植物基因組，直接獲得無載體骨架無選擇標記的轉基因植株，但其轉化率和可重復性有待提高。 玉米

2、是重要的糧食兼飼料作物，在我國農業(yè)生產中占有非常重要的地位。本研究以玉米為試材，在花粉管通道法基礎上建立并優(yōu)化了子房滴注轉化方法，其操作要點是將DNA轉化溶液直接滴加在完全去除花柱的子房上。首先通過苯胺蘭染色觀察花粉管確定轉化操作開始時間為授粉后16 h，然后利用子房滴注法轉化無載體骨架無選擇標記的線性GFP基因轉化元件(GFP基因表達框兩側分別包含25bp T-DNA左右邊界序列)。對FITC標記的線性轉化元件進行顯微觀察和示蹤，結果

3、表明子房滴注法與花粉管通道法相比，縮短了外源DNA進入胚囊的路徑和時間；轉化緩沖液0.05％ Silwet L-77+5％sucrose縮短了外源DNA進入胚囊的時間并加大進入量。通過PCR檢測，確定適合子房滴注法轉化的玉米品種為9818，最佳轉化時間為授粉后18～20 h，最佳轉化緩沖液成分為0.05％ Silwet L-77+5％ sucrose，在此條件下PCR陽性率達到6.47％。 本研究進一步對線性GFP基因轉化元件在

4、轉基因植物基因組中的整合方式、拷貝數(shù)、表達情況和后代遺傳規(guī)律進行了分析。Southern blot結果表明GFP基因以低拷貝數(shù)、簡單的方式(1～3條Southern雜交帶)整合到玉米基因組；Northern blot結果表明GFP基因在轉錄水平上表達；在轉基因植株的根和幼胚中觀察到GFP表達；轉基因植株的后代遺傳分析表明GFP基因能夠遺傳至T2代并正常表達，部分轉基因株系中的GFP基因以孟德爾遺傳方式傳遞給T1代，但T2代不符合孟德爾分

5、離比。 為了驗證玉米子房滴注法的可重復性，本研究將分別包含T-DNA邊界和LKR/SDH(lysine-ketoglutarate reductase/saccharopine dehydrogenase)邊界的線性GUS基因轉化元件(LKR/SDH基因5’端部分序列-CaMV35S-GUS基因-nos-LKR/SDH基因3’端部分序列)轉化玉米，PCR陽性率分別為7.2％和11.5％。結果表明，玉米來源的LKR/SDH基因部分

6、序列作為線性轉化元件的邊界可提高轉化率；子房滴注法由于規(guī)范了操作要點、確定了最佳轉化時間和轉化緩沖液而具有較高的轉化率和良好的重復性。對包含LKR/SDH邊界的線性GUS基因轉化元件在轉基因植物中的整合、表達和遺傳規(guī)律也進行了分析，Southern blot結果表明GUS基因以簡單的方式(1～2條Southern雜交帶)整合到玉米基因組；RT-PCR結果表明GUS基因在轉錄水平上表達；組織化學染色結果表明GUS基因在轉基因植株的根、葉和

7、幼胚中正常表達；對4個T1代轉基因株系的組織化學染色和PCR檢測結果表明，GUS基因以孟德爾分離方式遺傳并正常表達。 由于子房滴注法的轉化率受到不同玉米品種子房外部形態(tài)的影響，為了完善無載體骨架無選擇標記的玉米遺傳轉化體系，本研究利用花粉管通道法轉化線性GFP基因轉化元件，并建立了簡便、高效的檢測方法。首先確定玉米花粉管通道法的操作要點：授粉后17～18 h，與穗軸頂部相齊切掉花柱和苞葉，將轉化元件溶液滴加在花柱上。通過觀察GF

8、P在幼胚中的表達確定花粉管通道法的轉化部位(籽粒位于玉米果穗的5～8圈)；然后利用PCR檢測和觀察GFP表達從位于轉化部位的籽粒中篩選轉基因植株，檢出率提高到4.96％，并進一步驗證了花粉管通道法的轉化部位；Southern blot結果表明GFP基因以簡單的方式整合到玉米基因組；Northern blot結果表明GFP基因在轉錄水平上表達。 本研究建立了具有較高轉化率的子房滴注轉化法和適用于花粉管通道轉化的簡便、高效的檢測方法