一種無載體無選擇標記基因轉(zhuǎn)化小麥方法的建立.pdf

1、隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因作物的安全性越來越引起人們的重視。其中在基因轉(zhuǎn)化中普遍使用的選擇標記基因和載體骨架序列是影響轉(zhuǎn)基因作物安全性評價的兩個重要因素。目前，基因槍和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法均較難實現(xiàn)無載體無標記基因的轉(zhuǎn)化，而花粉管通道法則有望解決這一問題，雖然該方法也存在著轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差等缺點。 為了建立一種簡便有效地進行無載體無標記基因轉(zhuǎn)化小麥的方法，本文在對小麥花粉管通道法研究的基礎(chǔ)上，提出了小麥的子房滴注轉(zhuǎn)化法，并在

2、轉(zhuǎn)化中使用了不含選擇標記基因和載體骨架序列的最小基因表達框(只含有ubiquitin啟動子、smgfp基因、nos終止子和T-DNA邊界序列)。 本文首先對影響小麥花粉管通道法轉(zhuǎn)化的幾個可能因素的進行了初步研究，包括對花粉管生長情況的觀察和外源DNA的FITC(Fluorescein Isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)示蹤觀察。其中FITC示蹤又包括觀察轉(zhuǎn)化時間和轉(zhuǎn)化溶液對外源DNA進入小麥胚囊效率的影響，以及不同

3、轉(zhuǎn)化部位對外源DNA進入方式的影響等。結(jié)果表明，在授粉20min后，小麥花粉管可以進入子房；推測外源DNA沿花粉管延伸過程中形成的花粉管通道進入胚囊；轉(zhuǎn)化部位對外源DNA進入子房的方式有影響，傷口加深，外源DNA進入的量相對較多；在授粉45和60min以后進行轉(zhuǎn)化，外源DNA進入小麥胚囊的效率較高；相對于TE緩沖液，使用0.05％Silwet L-77+5％蔗糖作為轉(zhuǎn)化溶液可以縮短外源DNA進入胚囊的時間。 在以上實驗結(jié)果的基

4、礎(chǔ)上，本文提出了小麥的子房滴注轉(zhuǎn)化法。實際轉(zhuǎn)化操作表明，子房滴注轉(zhuǎn)化法的PCR陽性率(4.5％)要高于花粉管通道法(2.0％)。此后，本文又從轉(zhuǎn)化時間和轉(zhuǎn)化溶液組成等方面對前者進行了優(yōu)化。結(jié)果表明子房滴注轉(zhuǎn)化法在使用0.05％Silwet L77+5％蔗糖的水溶液作為轉(zhuǎn)化溶液，轉(zhuǎn)化時間為60～90min時可以得到較高的轉(zhuǎn)化率(8.3％)；Southern雜交檢測表明，外源DNA已經(jīng)整合到小麥基因組上；RT-PCR及Northern雜交檢