無選擇標記高含類黃酮抗晚疫病馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界上第四大糧食作物，由疫霉菌（Phytophthora infestans de Bary）引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上的一種毀滅性病害。類黃酮是一類天然的植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化和抗病毒病等重要功能，而目前廣泛種植的馬鈴薯品種中僅含有痕量的類黃酮。本研究通過轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物類黃酮調(diào)控基因AtMYB12、馬鈴薯野生種來源的抗晚疫病基因Rpi-vnt1.1、Rpi-mcq1.1和Rpi

2、-mcq1.2基因，獲得一系列不同組合富含黃酮醇（如蘆丁等）和抗晚疫病基因的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因品系。有望從晚疫病抗性和營養(yǎng)價值上對現(xiàn)有品種進行改良。主要研究內(nèi)容包括：
　　 ⑴利用Cre/lox特異位點重組系統(tǒng)載體pX6-GFP，采用高保真PCR技術(shù)，通過分步克隆的策略，分別構(gòu)建了pX6-patatin::AtMYB12；pX6-Rpi-mcq1.1-Rpi-mcq1.2；pX6-patatin::AtMYB12-Rpi-mcq1.1

3、-Rpi-vnt1.1等三個載體，并導入農(nóng)桿菌工程菌AGL I中。采用莖段轉(zhuǎn)化法將上述3個載體轉(zhuǎn)化晚疫病感病栽培種Desiree，分別獲得PCR陽性轉(zhuǎn)基因植株28株、20株和20株，陽性轉(zhuǎn)化效率分別達到68％、40％和45％。
　　 ⑵利用6個不同來源的馬鈴薯晚疫病菌株，采用離體葉片接種的方法對攜帶抗病基因的轉(zhuǎn)基因系進行抗病性檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)pX6-Rpi-mcq1.1-Rpi-mcq1.2雙基因植株高抗EC1，90128兩個菌

4、株；轉(zhuǎn)pX6-patatin::AtMYB12-Rpi-mcq1.1-Rpi-vnt1.1三基因植株抗所有檢測的六種菌株。研究結(jié)果與預期相符，所選基因完整被轉(zhuǎn)入到馬鈴薯品種Desiree中。
　　 ⑶利用HPLC法對兩個攜帶AtMYB12基因的部分轉(zhuǎn)基因株系進行了類黃酮含量檢測，轉(zhuǎn)基因pX6-patatin::AtMYB12馬鈴薯中蘆丁含量在0.051-3.091mg g-1之間，山奈酚-蕓香糖苷的含量達到0.041-0.951

5、mg g-1之間。轉(zhuǎn)pX6-patatin::AtMYB12-Rpi-mcq1.1-Rpi-vnt1.1馬鈴薯中類黃酮蘆丁含量在0.08-0.2 mg g-1之間?？傮w類黃酮含量顯著提高。
　　 ⑷基于抗病表型或類黃酮含量分析，以及外觀株型性狀的穩(wěn)定性，每個轉(zhuǎn)基因組合各選擇了2個株系進行了β-雌二醇的誘導處理，經(jīng)NPTII基因特異性引物分析，分別獲得無抗生素篩選標記的轉(zhuǎn)基因株系并重新進行了抗病性檢測。結(jié)果表明β-雌二醇的誘導產(chǎn)生