家蠶BmACCi蛋白的抗體制備和定位分析.pdf

1、在本實(shí)驗(yàn)室的家蠶蛹cDNA文庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼家蠶未知蛋白的EST序列。以該序列為信息探針，從SilkBase數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到一條cDNA序列。該cDNA序列含有編碼家蠶該未知蛋白的完整的ORF并經(jīng)序列比對(duì)，該ORF序列所編碼的蛋白與相近物種如岡比亞按蚊(ENSANGP00000010532)，埃及伊蚊(conservedhypothetica.protein)，果蠅(CG10473-PA，isofor.A)有較高同源性，皆在55％左右；

2、與家犬和小鼠的apoptoti.chromati.condensatio.inducer蛋白同源性也在55％左右，為研究方便，故將其命名為BmACCi(Bomby.mor.apoptoti.chromatincondensatio.inducer-lik.protein)，基因登陸號(hào)為FJ602776。該ORF序列長(zhǎng)為627bp，其編碼的蛋白質(zhì)BmACCi為208個(gè)氨基酸，該蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)以及分子量分別為9.37和24.4.kDa，

3、屬于堿性蛋白質(zhì)。
　　 我們將擴(kuò)增到的BmACCi基因插入到融合表達(dá)載體pET-28a相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，得到融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-BmACCi，經(jīng)PCR，酶切鑒定以及測(cè)序證明重組子是正確的。將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用終濃度為.mM的IPTG誘導(dǎo)重組菌后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，在2.kDa左右的位置有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期值(融合標(biāo)簽3.5.kDa，BmACC.24.4.kDa)相符。融合

4、蛋白以可溶性形式存在，故用超聲裂解菌體后1200.rpm離心所得的上清以親和層析的方法純化目的蛋白His-ta.BmACCi。以純化所得蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔，制備了該重組蛋白的多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該抗血清的效價(jià)可達(dá)到1：8000以上。提取家蠶五齡幼蟲的各組織蛋白，用于Wester.blotting實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BmACCi蛋白在家蠶的頭、絲腺、氣管、卵巢、睪丸、脂肪體等組織中都有表達(dá)，且在頭部和氣管中表達(dá)量最高，而在表