家蠶THY超家族蛋白的表達(dá)功能分析和亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一條cDNA序列(基因登錄號(hào)為FJ602790)，該序列是由3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子剪接而成。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其ORF為39.bp，編碼132個(gè)氨基酸殘基。將推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行同源性(BlastP)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)此蛋白序列含有兩個(gè)TH.(Thymosin)保守結(jié)構(gòu)域，屬保守假定蛋白，因此將其命名為BmTHY，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其分子量為14.74kDa，等電點(diǎn)為4.83。
　　 我們利用大腸桿

2、菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了含有His標(biāo)簽的BmTHY融合蛋白，預(yù)測(cè)分子量合計(jì)為18.4kDa，主要以可溶形式存在于上清中，用N.Sepharos.6Fas.Flow親和層析柱純化融合的目的蛋白，經(jīng)FPLC反相柱層析進(jìn)一步純化，進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到該融合蛋白的分子量為18.409kDa，證實(shí)了該蛋白表達(dá)的正確性。用得到的純化融合蛋白為抗原免疫新西蘭白兔，制備該融合蛋白的多克隆抗體。ELISA檢測(cè)該抗血清(多克隆抗體)的效價(jià)可達(dá)到1:25600以上

3、。用制備的多克隆抗體進(jìn)行Wester.blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BmTHY蛋白在家蠶五齡幼蟲(chóng)組織中的卵巢，頭，皮均有表達(dá)，在蛹和蛾的發(fā)育階段有表達(dá)。熒光定量PCR的結(jié)果表明，家蠶BmTH.mRNA在家蠶的各個(gè)發(fā)育時(shí)期及不同組織中廣泛存在，其中在家蠶的各個(gè)發(fā)育時(shí)期中，蛾的表達(dá)量較高，卵的表達(dá)量較低；在五齡幼蟲(chóng)的頭、卵巢、中腸、馬氏管、氣管、表皮、脂肪體，絲腺等組織中BmTHY的mRNA含量依次減少。用免疫熒光的方法對(duì)家蠶的Bm5細(xì)胞進(jìn)行亞